¿Revolución o mera evolución? Citometría de flujo y verificación de la limpieza y desinfección en las instalaciones de fabricación de alimentos

La seguridad alimentaria depende en gran medida de las condiciones higiénicas de las instalaciones de fabricación de alimentos. Unos niveles elevados de bacterias de deterioro pueden afectar a la vida útil y la calidad de los alimentos, mientras que la presencia de patógenos (como la salmonela y la listeria) puede provocar enfermedades graves. Los fabricantes de alimentos deben ser diligentes a la hora de mantener su entorno de procesado limpio y libre de microorganismos patógenos para evitar la contaminación cruzada del producto final. Pero, ¿cómo se hace esto actualmente?

Inspección visual

Aunque la inspección visual es un requisito previo, en sí misma no es suficiente. Es un medio subjetivo e impreciso de verificar una limpieza adecuada. Y lo que es más importante, aunque una superficie no tenga residuos aparentes, esto no significa que esté inmaculada. La inspección visual no puede garantizar que se hayan limpiado todos los residuos alimentarios de la pasada o que un desinfectante haya reducido eficazmente el nivel microbiano de la superficie.

Enumeración microbiana con métodos basados en cultivos

Estos son los métodos tradicionales para controlar la higiene del entorno de procesado. En general, hay dos formas de realizar el muestreo: basado en el contacto y basado en el hisopado. Con los métodos basados en el contacto, se colocan placas o láminas de inmersión en la superficie que se va a muestrear y luego se incuban. El muestreo basado en el hisopado se realiza con bastoncillos o esponjas que se enjuagan en una solución tampón que luego se inocula en medios estériles y se incuba. La principal limitación de estos métodos tradicionales de determinación microbiana es la cantidad de tiempo que se tarda en obtener resultados. Además, la mayoría de las especies de bacterias no pueden cultivarse en agar, un fenómeno conocido como la anomalía de la gran cuenta en placa.

Detección de ATP

El trifosfato de adenosina (ATP) es un nucleótido que las células utilizan para suministrar energía. Puede considerarse como la "unidad monetaria" molecular de la energía dentro de todas las células vivas. La energía se transfiere cuando el ATP se descompone en su nucleósido y su fosfato libre. La hidrólisis de los enlaces covalentes de los fosfatos libera energía que se utiliza para las reacciones. Los sistemas comerciales de prueba del ATP aprovechan la reacción luciferina/luciferasa, muy común en la naturaleza, para generar luz con la energía proporcionada por el ATP. Cuanta más luz se emite, más ATP hay presente, lo que podría indicar indirectamente más residuos alimentarios o (potencialmente) más microorganismos. Sin embargo, hay una advertencia importante: como estos sistemas dependen de una reacción enzimática, los posibles inhibidores o unas condiciones ambientales menos que óptimas podrían provocar resultados erróneos. La temperatura ambiental podría aumentar los tiempos de reacción, mientras que la luz podría dificultar la obtención de lecturas correctas. Además, los desinfectantes pueden interferir en la reacción, lo que significa que podría no haber una correlación real entre las bacterias vivas presentes en la superficie y los resultados de la medición del ATP. De ahí que los métodos basados en el ATP se utilicen normalmente para analizar las superficies antes de la aplicación del desinfectante. Los métodos de ATP albergan otra desventaja: dependen en su aplicabilidad de la naturaleza del alimento que se procesa. La mayoría de los alimentos dejan residuos que contienen grandes cantidades de ATP, que superan en varios órdenes de magnitud a las cantidades contenidas en el interior de las células bacterianas. En la práctica, esto significa que los sistemas de ATP no pueden utilizarse para evaluar la contaminación microbiana de las superficies en la mayoría de las instalaciones de procesado de alimentos. Aunque no se pueden contar directamente las bacterias, los sistemas ATP se emplean ampliamente porque los resultados se generan en cuestión de segundos, un tiempo de obtención de resultados del que no disponía ninguna otra tecnología comúnmente disponible hasta ahora.

Introducción a la citometría de flujo

La citometría de flujo (FCM) hace referencia a un grupo de técnicas que utilizan señales ópticas o eléctricas para detectar y medir determinadas propiedades físicas o químicas de las células y partículas suspendidas en un fluido. Casi 300 estudios realizados entre 2000 y 2018 evaluaron la FCM como herramienta para caracterizar la calidad microbiana del agua. Estas investigaciones pudieron ilustrar el valor del FCM en el tratamiento, la distribución y la reutilización del agua. Ahora existe un corpus de investigación que documenta aplicaciones exitosas del FCM lo suficientemente sólido como para sugerir que podría ver de forma razonable y realista una adopción generalizada como método rutinario para la evaluación de la calidad del agua. ¿Qué tiene que ver todo esto con la evaluación de la eficacia de la limpieza y la desinfección en las instalaciones de fabricación de alimentos? Los métodos antes habituales en la determinación de la calidad del agua solían estar limitados por su baja sensibilidad, sus elevados requisitos de mano de obra y tiempo, su susceptibilidad a las interferencias de compuestos inhibidores y sus dificultades para distinguir entre células viables y no viables. (Todo esto le suena familiar, ¿verdad?) Pero tenga cuidado: los citómetros de flujo de fluorescencia son, por lo general, aparatos poco manejables y caros que requieren personal altamente cualificado para su manejo.

Llevar la potencia de la citometría de flujo a un dispositivo portátil

Para que la FCM sea una solución viable para la verificación de la limpieza en las instalaciones de procesado de alimentos, es necesario que se presente en un formato portátil que sea sencillo y fácil de usar, pero lo suficientemente preciso como para proporcionar recuentos fiables de bacterias y partículas residuales en las muestras ambientales. Esto ha sido posible gracias al uso de la citometría de flujo por impedancia. La citometría de flujo por impedancia es un tipo específico de citometría de flujo: en lugar de sistemas ópticos como la tecnología láser, los citómetros de flujo por impedancia emplean una corriente alterna a frecuencias variables que permiten al dispositivo detectar y contar células y partículas residuales por separado. Mientras que los citómetros de flujo de base óptica sólo son capaces de contar células etiquetadas con colorantes, los citómetros de flujo de impedancia pueden realizar la misma operación sin necesidad de etiquetado. En comparación con otros dispositivos de citometría de flujo, son compactos, portátiles y funcionan con pilas, lo que permite utilizarlos allí donde se tome la muestra.

¿Cómo pueden los citómetros de flujo de impedancia distinguir entre células y partículas residuales?

Las propiedades electromagnéticas de las bacterias permiten a los citómetros de flujo distinguirlas de otras partículas. El citoplasma y la membrana celular de una bacteria modifican el campo eléctrico de formas únicas e identificables. Mientras que la corriente eléctrica se moverá a través de las partículas metálicas casi sin impedimentos, las partículas no conductoras se resisten al campo. Las bacterias intactas, sin embargo, se parecen tanto a las partículas no conductoras como a las conductoras: la membrana celular impide que las bajas frecuencias penetren en ella, lo que hace que se parezcan a las partículas no conductoras; a altas frecuencias, sin embargo, la corriente eléctrica penetra en la membrana. Los microelectrodos del citómetro de flujo de impedancia generan estos campos eléctricos y permiten al dispositivo cuantificar los cambios en la conductividad y la resistencia en términos de mediciones separadas de células intactas y partículas.

Aplicación de la citometría de flujo de impedancia a la seguridad alimentaria: introducción de CytoQuant

Como ya se ha mencionado, una ventaja que presentan los citómetros de flujo de impedancia sobre otros tipos de dispositivos citométricos es su portabilidad. Ligeros, pequeños y alimentados por pilas, pueden funcionar sobre el terreno y en puntos de control críticos en los que la higiene es una preocupación primordial. El citómetro de flujo de impedancia CytoQuant® está diseñado para su uso precisamente en estas áreas, incluidas las instalaciones de producción de alimentos y las salas blancas. La citometría de flujo por impedancia aporta ventajas considerables a los productores de alimentos que buscan verificar su seguridad alimentaria y sus programas de limpieza: la cuantificación rápida y por separado de bacterias y partículas residuales (que pueden servir como indicador de la eficacia de la limpieza), la sensibilidad del método y la robustez del kit de hisopado y del propio citómetro. El sistema CytoQuant® es fácil de utilizar, ya que el dispositivo se encarga de todo el trabajo excepto de la toma de muestras. Una prueba comienza con el hisopado de una zona predefinida (por ejemplo, 20 x 20 cm u 8 x 8 pulgadas) de la superficie que se va a analizar. Continúa colocando el hisopo en un tubo que contiene una solución conductora patentada y, a continuación, agitando el kit de hisopos para suspender las bacterias. Cuando se analizan aguas de enjuague, la muestra se introduce directamente en un vial vacío y, a continuación, se añaden unas gotas de solución electrolítica. Tras mezclar la muestra, el usuario introduce el vial en el CytoQuant®. Dos agujas penetran en el fondo del tubo, conectando el líquido al sistema de flujo del aparato. A continuación, tras introducir la solución en el sistema de flujo, ésta pasa por los electrodos de la célula de flujo. Al cabo de 30 segundos, el dispositivo registra resultados separados para bacterias y partículas y los muestra en la pantalla.

¿Revolución o evolución?

El citómetro de flujo móvil CytoQuant® permite la verificación inmediata e in situ de los procedimientos de limpieza y desinfección en instalaciones de producción de alimentos u otras áreas en las que la higiene es crucial. Al cuantificar directamente las bacterias y las partículas residuales en las superficies sin la influencia negativa de los desinfectantes o la temperatura, proporciona ventajas sustanciales sobre los dispositivos ATP, mientras que el tiempo de obtención de resultados de 30 segundos lo convierte en una mejora perfecta para los programas de higiene que ya utilizan métodos culturales. Teniendo en cuenta el enorme potencial de la citometría de flujo por impedancia, es posible que en algún momento llegue a considerarse igual o incluso sustituya a los métodos culturales como estándar en la verificación de la limpieza. Esto supondría una auténtica revolución en este campo.