Les défis des tests d'allergènes - dopage et récupération

Lorsque j'ai commencé à développer des immunodosages pour la détection d'allergènes dans les aliments, la première chose qui m'a frappée a été le large éventail de types d'aliments ou de matrices avec lesquels les tests devaient fonctionner. Venant d'une formation en immunodosage médical, j'avais un nombre limité de matrices différentes avec lesquelles travailler. Dans mon cas, il s'agissait de sérum sanguin. Avec les aliments, il existe une gamme presque infinie de types d'échantillons différents, chacun ayant ses propres propriétés.

Comment choisir le bon kit de test ?

Comment s'assurer que le kit de test produit est adapté à une gamme d'échantillons aussi diversifiée et difficile à utiliser ? C'est là qu'intervient la validation de l'échantillon. Le processus consiste à ajouter une quantité connue d'un allergène d'intérêt à notre matrice (pic) et à essayer ensuite de récupérer cet allergène (récupération). Il est important de se rappeler que, comme leur nom l'indique, les immunodosages utilisent des composants biologiques (anticorps) pour détecter les protéines allergènes d'intérêt. Comme tous les systèmes biologiques, les kits sont sensibles aux extrêmes. Dans le cas des aliments, les kits peuvent ne pas fonctionner comme ils le devraient en présence d'un acide ou d'un alcali fort, d'une forte teneur en sel, d'une forte teneur en matières grasses, etc. Bon nombre de ces extrêmes peuvent être contrés au cours du processus d'extraction. Les kits utilisent donc un système tampon pour faire face aux changements de pH et l'ajout du tampon à l'échantillon permet de réduire et de diluer certains des autres problèmes tels que le sel et les graisses.

Ma récupération est-elle acceptable ?

Lorsqu'il s'agit de récupérer une quantité connue d'allergènes à partir d'une matrice d'échantillon, qu'est-ce qui est considéré comme acceptable ? Avant de répondre à cette question, nous devons définir notre point de départ. S'agit-il d'un échantillon subi ou d'un échantillon dopé ?

Les échantillons subis sont définis comme des échantillons dans lesquels une quantité connue d'allergène alimentaire a été incorporée au cours du traitement, reproduisant aussi fidèlement que possible les conditions réelles dans lesquelles la matrice de l'échantillon serait normalement fabriquée.

Le sujet des échantillons subis sera abordé plus en profondeur dans un prochain numéro de Spot On. Dans cet article, je me concentrerai sur une méthode plus accessible consistant à introduire une quantité connue d'allergène dans une matrice telle qu'elle est reçue du fournisseur ou du fabricant et à mesurer sa récupération.

En ce qui concerne la récupération, le guide stipule ce qui suit :

"Les taux de récupération idéaux se situent entre 80 et 120 %. Les niveaux de récupération sont influencés à la fois par l'efficacité de l'étape d'extraction et par la procédure ELISA.

"Avec les méthodes ELISA pour les allergènes alimentaires, ce niveau de récupération n'est pas toujours possible, en particulier lorsque certaines matrices difficiles sont analysées. De plus, la récupération à partir d'échantillons subis peut être substantiellement différente de celle obtenue à partir d'échantillons dopés.

"C'est pourquoi des taux de récupération compris entre 50 et 150 % seront considérés comme acceptables, à condition qu'ils soient cohérents.

Les lignes directrices ont été publiées en 2010 par l'Association of Analytical Communities (AOAC), avec une référence particulière aux méthodes quantitatives ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). De nombreux points clés sont également applicables aux méthodes qualitatives ou semi-quantitatives LFD (Lateral Flow Device).

La "science" derrière le dopage

Lorsque nous recevons ou rencontrons un nouveau type d'aliment qui n'a pas été testé auparavant, nous procédons à la validation de la récupération des pointes pour nous assurer qu'il fonctionne comme il se doit avec nos kits de test. Nous procédons à un dopage à trois niveaux d'allergènes différents - faible, moyen et élevé - afin de couvrir la plage de détection du test.

Le pic d'allergène faible sera proche de la limite inférieure de quantification (LLOQ) du test ELISA (dans ce cas, la valeur la plus faible du calibrateur au-dessus de 0 ppm) ou proche de la limite de détection (LOD) d'un dispositif à flux latéral. Le pic moyen se situe au milieu de la courbe d'étalonnage ELISA et le pic élevé se situe à la limite supérieure de quantification, ULOQ (la valeur la plus élevée du calibrateur en ppm) ou à proximité de celle-ci. L'échantillon est extrait et testé conformément à la notice du produit fournie avec le kit.

Ainsi, par exemple, si nous ajoutons 5 ppm d'amandes au chocolat, nous nous attendons à obtenir un résultat compris entre 4 ppm et 6 ppm. Si le résultat se situe en dehors de cette fourchette, des mesures peuvent être prises pour améliorer la récupération. Par expérience, le chocolat est l'une des matrices alimentaires les plus difficiles à tester - il est plein de tanins et d'autres polyphénols qui peuvent se lier à toute protéine allergène éventuellement présente et former des complexes insolubles qui sont difficiles à extraire.

Ces difficultés peuvent être surmontées en ajoutant des protéines supplémentaires au tampon d'extraction. L'excès de protéines se lie aux polyphénols et rend les allergènes disponibles pour l'extraction. Ma protéine de prédilection est la gélatine de poisson, bien que d'autres matériaux tels que le lait en poudre puissent être utilisés pour améliorer l'efficacité de l'extraction à partir d'aliments contenant beaucoup de polyphénols. Si vous utilisez du lait en poudre, veillez à ne pas contaminer votre laboratoire, en particulier si vous effectuez des tests sur les allergènes du lait.

Les dispositifs à flux latéral, ou les bandelettes ou bâtonnets, comme on les appelle parfois, peuvent être validés pour la récupération des pics de la même manière qu'un kit de test allergène ELISA. Lorsqu'on choisit un niveau de pic élevé, il faut savoir que, bien que les dispositifs à flux latéral soient capables de détecter des niveaux de ppm très élevés, on peut en fait surcharger l'appareil en ajoutant une trop grande quantité d'allergènes. Cela peut se produire dans des quantités supérieures à 1 % de l'aliment allergène.

Maintien de la qualité et de la précision des tests

Il peut être nécessaire pour un fabricant de kits de travailler en étroite collaboration avec des clients qui testent régulièrement des matrices alimentaires difficiles. Il est important de vérifier que le kit fonctionne comme il se doit et à la satisfaction du client. Ceci peut être réalisé, comme détaillé ci-dessus, en entreprenant des expériences de récupération de pointes d'allergènes dans la matrice problématique.

Dans certains cas, il peut être souhaitable de modifier ou de changer la méthode du kit standard pour répondre aux exigences de l'échantillon et/ou du client ; cela doit toujours être entrepris avec les conseils du fabricant du kit pour garantir la qualité et la reproductibilité du kit de test.