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Comment développer une méthode multi-mycotoxines basée sur la LC-MS/MS ?
Les cultures céréalières et les matières premières sont souvent contaminées par plusieurs mycotoxines. Romer Labs développe une méthode unique capable de détecter simultanément plusieurs mycotoxines. Irene Hahn explique comment.
Il existe environ 400 composés de faible poids moléculaire qui sont reconnus comme des mycotoxines, chacun ayant des effets toxiques différents pour l'homme et l'animal. Le nombre élevé de contaminants possibles, ainsi que les rapports répétés sur la cooccurrence des mycotoxines, rendent nécessaire la mise au point de méthodes de détection appropriées, telles que les méthodes multi-mycotoxines basées sur la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse (LC-MS/MS), pour analyser simultanément plusieurs mycotoxines. La mise au point de ces méthodes est un défi, car l'inclusion de plusieurs toxines ayant des propriétés chimiques différentes dans une seule analyse signifie que des compromis doivent être faits lors du choix des paramètres optimaux de la méthode.
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Mycotoxine
Analyse des mycotoxines par LC-MS/MS
Les méthodes analytiques basées sur la LC en phase inversée couplée à la MS (LC-MS/MS) sont devenues une technique puissante et de pointe pour l'analyse qualitative et quantitative des mycotoxines au cours de la dernière décennie. Les avantages de cette méthode sont la sensibilité et la sélectivité élevées, l'application à l'analyse de plusieurs mycotoxines ainsi que la fourniture d'informations supplémentaires sur les rapports masse/charge (m/z) et les ions fragments des analytes étudiés. Actuellement, on observe une forte tendance à l'application de méthodes multi-mycotoxines obtenues par LC-MS/MS. Cette technique permet la détermination simultanée d'une large gamme de mycotoxines appartenant à différentes familles chimiques en une seule mesure. Cependant, des questions telles que la diversité chimique des composés eux-mêmes, le large éventail de produits agricoles testés, les gammes de concentration variables et les différentes distributions d'occurrence sont autant de défis pour le développement et l'optimisation des méthodes. Par conséquent, des compromis doivent être faits dans le choix du solvant d'extraction et de la phase mobile, et les conditions peuvent être loin d'être optimales pour certains analytes, qui comprennent des composés acides (fumonisines), basiques (alcaloïdes de l'ergot), ainsi que polaires (moniliformine, nivalénol) et apolaires (zéaralénone, beauvéricine). En outre, l'absence de normes analytiques appropriées disponibles dans le commerce pour certains analytes ne permet d'obtenir que des déclarations de dépistage qualitatives plutôt que des résultats quantitatifs.
Développement d'une méthode LC-MS/MS multi-mycotoxines
En général, les méthodes de quantification des mycotoxines dans les céréales et les produits à base de céréales comprennent un échantillonnage représentatif, une procédure optimisée de préparation de l'échantillon et une étape de nettoyage, ainsi que la technique analytique, y compris la séparation et la détection. Celles-ci et les paramètres pris en compte sont résumés dans la figure 1. Au cours du développement et de l'optimisation de la méthode, les paramètres influencent considérablement la qualité et la fiabilité des résultats et doivent être évalués avec soin. À cette fin, il convient d'utiliser des étalons analytiques de chaque composé dont la pureté est indiquée. Toutefois, pour certains analytes, les étalons analytiques ne sont pas disponibles dans le commerce. Dans ce cas, il peut être possible d'accéder à des étalons qui font encore l'objet de recherches, ou de travailler avec du matériel disponible moins bien caractérisé.
Développement de la méthode
Au cours du développement d'une méthode LC-MS/MS, les paramètres MS et LC, ainsi que la procédure de préparation de l'échantillon, doivent être définis. Pour l'optimisation des paramètres MS, chaque composé doit être injecté en tant qu'étalon analytique pur directement dans le spectromètre de masse. Ensuite, le mode d'idéalisation (positif ou négatif), les ions précurseurs et produits les plus abondants, ainsi que les potentiels de déclustering, les énergies de collision et les potentiels de sortie de la cellule de collision idéaux doivent être évalués. Lors de l'optimisation des paramètres LC, les phases mobiles et le gradient idéaux ainsi que la colonne chromatographique optimale doivent être évalués. La méthode de choix pour la procédure de préparation de l'échantillon lors de l'analyse de mycotoxines multiples est une approche de dilution et de tir sans nettoyage de l'échantillon afin de ne pas altérer le profil des mycotoxines lors de la préparation de l'échantillon. Par exemple, il est rare que l'on dispose d'un nettoyage (par exemple, extraction en phase solide) qui ne supprime aucun des analytes requis. Néanmoins, en l'absence de nettoyage, les composants de la matrice qui co-éluent et interfèrent peuvent affecter l'efficacité d'ionisation des analytes cibles, ce qui se traduit par une répétabilité et une précision moindres. Il est donc essentiel de déterminer et de compenser ces effets de matrice. Cela peut se faire par la détermination de la récupération apparente suivie d'une correction des résultats avec cette valeur, par un étalonnage adapté à la matrice ou par l'utilisation d'étalons internes marqués par des isotopes. Cette dernière méthode permet d'obtenir des résultats d'une précision et d'une fiabilité maximales, tout en minimisant le temps et les coûts d'investissement.
Optimisation de la méthode
L'optimisation de la méthode analytique comprend des tests de stabilité des analytes dans la solution standard et les échantillons, ainsi que la vérification de la sélectivité et la détermination de la plage de travail.
Validation de la méthode
La validation de la méthode est une condition préalable à la production de résultats fiables en termes de comparabilité et de traçabilité. La validation de la méthode doit être effectuée séparément pour chaque analyte cible dans toutes les matrices requises. Les caractéristiques de performance typiques qui doivent être évaluées lors de la validation d'une méthode quantitative sont les limites de détection (LOD), les limites de quantification (LOQ), la linéarité, la précision, la sélectivité, la robustesse, l'exactitude, les effets de matrice et les récupérations. La validation de la méthode peut être effectuée en dopant des échantillons vierges avec chaque analyte requis à une gamme de concentrations répétées. Lorsqu'elle est disponible, la justesse de la méthode doit être confirmée à l'aide de matériaux de référence certifiés. En outre, les matériaux adaptés à la matrice et la participation à des essais d'aptitude permettent une assurance qualité supplémentaire. Le nombre limité de matériaux de référence est notamment responsable du caractère semi-quantitatif de ces méthodes de dépistage. Bien que les méthodes multi-toxines soient déjà mises en œuvre dans les analyses de routine, les coûts élevés d'investissement et de maintenance doivent être pris en compte.
Mise en œuvre de la méthode
Lors de la mise en œuvre, des échantillons réels ainsi que des échantillons de contrôle de la qualité doivent être mesurés à l'aide de la méthode validée. En outre, la méthode validée doit être mise en œuvre et utilisée dans les laboratoires de routine, ce qui peut s'avérer difficile en termes de disponibilité du personnel de laboratoire et de l'instrumentation.
Défis généraux pour la détermination des mycotoxines
En général, les contaminations par les mycotoxines sont réparties de manière hétérogène dans les cultures agricoles et peuvent être concentrées dans des "points chauds". L'échantillonnage représente donc une étape importante et cruciale, car un échantillon représentatif est essentiel pour la détermination précise et exacte des niveaux de mycotoxines. La majorité des techniques analytiques ne permettent pas de détecter directement les mycotoxines dans les échantillons de céréales moulues, ce qui nécessite des procédures de préparation des échantillons.
Une autre étape importante est l'extraction de l'échantillon. Au cours d'une extraction solide-liquide conventionnelle, les mycotoxines sont extraites des échantillons de céréales moulues par agitation mécanique avec différents mélanges de solvants (aqueux et organiques), parfois également avec des modificateurs acides ou alcalins. Les extraits obtenus peuvent ensuite être utilisés pour l'analyse. La plupart des méthodes analytiques développées à des fins réglementaires et scientifiques sont basées sur la séparation chromatographique, principalement la chromatographie liquide (CL), en combinaison avec une variété de détecteurs. Les détecteurs de CL pour la surveillance et la détection en continu des analytes qui s'éluent de la colonne chromatographique sont basés sur des mesures d'absorbance UV/Vis, de fluorescence et de spectrométrie de masse (SM). En raison des différentes propriétés chimiques et physicochimiques des mycotoxines, la majorité de ces méthodes analytiques ont été optimisées pour un composé cible ou, au mieux, pour un groupe de mycotoxines étroitement apparentées. En outre, ces méthodes ciblées comprennent souvent des étapes d'extraction et de nettoyage afin de réduire ou d'éliminer les composants indésirables de la matrice. Par conséquent, l'estimation de l'occurrence générée dépend toujours des échantillons analysés ainsi que des mycotoxines couvertes par les méthodes analytiques utilisées.
Conclusion
En conclusion, le développement d'une méthode multi-mycotoxines basée sur la LC-MS/MS est un défi lorsqu'il s'agit d'obtenir des données quantitatives fiables et comparables. Un grand nombre de paramètres différents qui influencent de manière significative la qualité et la fiabilité des résultats doivent être soigneusement pris en compte pour chaque analyte dans chaque matrice séparément. En outre, la diversité chimique des mycotoxines signifie que des compromis doivent être faits pendant le développement de la méthode, qui peut être loin d'être optimale pour certains analytes. En outre, le large éventail de produits agricoles ainsi que les gammes de concentration variables et les différentes distributions d'occurrence constituent un défi supplémentaire pour le développement et l'optimisation des méthodes. Néanmoins, le développement de méthodes multi-mycotoxines est certainement nécessaire et les progrès de cette technologie permettront d'en étendre l'application.