Technologies d'analyse rapide de l'hygiène de l'environnement : Un examen plus approfondi

Les technologies d'analyse environnementale couramment utilisées se divisent en deux approches générales : l'analyse des résidus et l'analyse des micro-organismes. Nous examinons ici les différentes technologies de chaque approche, leur fonctionnement, leur applicabilité et leurs avantages.

Recherche de résidus

Méthodes ATP

L'adénosine triphosphate (ATP) est un nucléotide utilisé dans les cellules comme coenzyme pour fournir de l'énergie. Il peut être considéré comme l'"unité monétaire" moléculaire pour le transfert d'énergie dans toutes les cellules vivantes. L'énergie est nécessaire à toutes les activités cellulaires, y compris la synthèse des protéines et des membranes, le mouvement cellulaire et la division cellulaire. L'énergie est transférée lorsque l'ATP se décompose en adénosine diphosphate et en adénosine monophosphate. L'hydrolyse des liaisons covalentes des phosphates libère de l'énergie qui est utilisée pour les réactions.

Les systèmes commerciaux de test de l'ATP exploitent la réaction luciférine/luciférase, très répandue dans la nature, pour générer de la lumière visible avec l'énergie fournie par l'ATP. Plus la lumière émise est importante, plus il y a d'ATP, ce qui indique la présence de résidus alimentaires ou de micro-organismes. Il y a cependant une mise en garde importante : comme ces systèmes sont largement utilisés pour valider l'efficacité du nettoyage, des désinfectants sont également couramment impliqués dans la réaction. Ces désinfectants peuvent perturber les parois cellulaires des micro-organismes mais préservent leur ATP, ce qui signifie qu'il peut ne pas y avoir de réelle corrélation entre les organismes vivants présents sur la surface et les résultats de la mesure de l'ATP.

Les méthodes ATP présentent un autre inconvénient potentiel : leur applicabilité varie en fonction du résidu alimentaire à détecter. Par exemple, les tests ATP ne se prêtent pas à l'analyse de la farine de blé, car il s'agit d'une matrice hautement transformée qui laisse peu d'ATP dans ses résidus. Les résidus de produits carnés, en revanche, contiennent des niveaux élevés d'ATP.

Méthodes de détection des protéines totales

Autre méthode d'analyse des résidus, les méthodes de détection des protéines totales testent non pas les micro-organismes eux-mêmes, mais plutôt les acides aminés, les peptides et les protéines. Ces tests sont très rapides et donnent des résultats en moins d'une minute. La détection n'est pas assez sensible pour détecter les protéines des micro-organismes unicellulaires. Par conséquent, un résultat négatif avec ce type de test n'indique pas l'absence du micro-organisme. En outre, cette méthode ne permet pas de détecter des agents pathogènes spécifiques. Cependant, les kits de détection des protéines ont leur utilité car ils peuvent donner des indications sur l'efficacité du nettoyage d'une manière rapide et abordable.

Tests sur les micro-organismes

Méthodes de culture chromogène

Il s'agit des méthodes traditionnelles de contrôle de l'hygiène de l'environnement de transformation. Les méthodes culturales sont abordées dans la norme ISO 18593, "Microbiologie de la chaîne alimentaire - Méthodes horizontales d'échantillonnage de surface". Des milieux sélectifs et non sélectifs peuvent être utilisés pour détecter des organismes spécifiques.

Méthodes à base de gélose chromogène

En règle générale, il existe deux façons de réaliser des méthodes à base de gélose : soit directement, soit indirectement par le biais d'une étape de dilution. Les deux méthodes présentent l'avantage de fournir des résultats quantitatifs.

Dans les méthodes directes, la gélose des plaques ou des dip-slides est pressée directement sur la surface à échantillonner. Les plaques de contact ont la forme de boîtes de Petri classiques et ont généralement une surface de 25 cm². Les dip-slides sont des palettes de gélose double face protégées par un tube en plastique et ont une surface de gélose de 7 à 10 cm² de chaque côté de la palette, soit 14 à 20 cm². Ces systèmes ne nécessitent aucun équipement supplémentaire et la procédure d'échantillonnage est très rapide. Cependant, la surface d'échantillonnage avec cette méthode est limitée.

Les écouvillons, les tissus et les éponges sont des outils d'échantillonnage indirect. Après avoir été tamponnés sur la surface à tester, ils sont dilués dans une solution tampon, qui est ensuite introduite à la pipette dans des boîtes de Pétri traditionnelles et étalée. La surface testée peut être beaucoup plus grande et les espaces étroits peuvent être testés avec une méthode indirecte. Toutefois, les méthodes indirectes présentent un inconvénient : les étapes de manipulation sont plus nombreuses et des fournitures supplémentaires sont nécessaires. Pour la détection des agents pathogènes, la norme ISO recommande une surface comprise entre 1000 cm² et 3000 cm² ; une surface aussi grande ne peut être manipulée qu'à l'aide d'éponges ou d'écouvillons.

Méthodes de détection en milieu liquide chromogène

Cette méthode de culture est utilisée uniquement pour détecter, et non pour compter, des organismes ou des groupes d'organismes spécifiques, car elle ne fournit pas de résultats quantitatifs. Dans les méthodes basées sur les milieux liquides, des écouvillons sont utilisés pour prélever des échantillons et sont ensuite placés dans des tubes remplis de milieux sélectifs. En moyenne, l'incubation dure au moins 48 heures pour les résultats présumés négatifs. Les échantillons positifs sont identifiés par un changement de couleur ou une florescence à une longueur d'onde spécifique de l'échantillon enrichi. Ces tests sont généralement faciles à utiliser et abordables.

L'inconvénient des systèmes basés sur les milieux liquides est leur faible degré de sensibilité, résultant de milieux très sélectifs, qui suppriment intentionnellement la croissance d'autres bactéries. Il y a là un certain risque : les bactéries présentes dans l'environnement de transformation sont déjà stressées et peuvent mourir si les milieux d'enrichissement sont trop sélectifs. Par ailleurs, si la sélectivité est trop faible, il peut être difficile de détecter des micro-organismes spécifiques en utilisant uniquement des milieux liquides sélectifs. L'interprétation des résultats peut devenir difficile et subjective, car le changement de couleur ou la florescence n'est pas toujours assez forte pour indiquer un résultat définitif. Le principal avantage des méthodes basées sur les milieux liquides est qu'elles sont faciles à utiliser et abordables.

Méthodes basées sur l'ADN

Il existe trois méthodes différentes basées sur l'ADN : l'amplification isotherme de l'ADN, la PCR en temps réel et la PCR traditionnelle. La PCR en temps réel est une méthode bien établie pour la détection de l'ADN ou de l'ARN, tandis que l'amplification isotherme est une technologie plus récente. L'amplification isotherme présente des avantages évidents par rapport à la PCR en temps réel : par exemple, l'amplification isotherme ne nécessite pas de thermocycleur car la réaction a lieu à une température constante. La méthode basée sur l'ADN la plus rentable, mais aussi la plus laborieuse, est la PCR traditionnelle, car il est nécessaire d'effectuer une étape d'hybridation ou d'utiliser un colorant peu spécifique après l'amplification pour détecter l'ADN ou l'ARN amplifié. Dans toutes les méthodes, des parties spécifiques de l'ADN ou de l'ARN sont reconnues par des amorces spécifiques, puis multipliées par l'enzyme polymérase. La sensibilité de ces méthodes est remarquablement élevée et les régions cibles de l'ADN ou de l'ARN sont bien connues. La principale limite de ce système est qu'il est basé sur des enzymes. Les enzymes ont besoin de solutions tampons spécifiques pour fonctionner correctement. Les ingrédients contenus dans les désinfectants peuvent influencer l'activité enzymatique, ce qui peut conduire à des résultats faussement négatifs. Cette technologie nécessite également de multiples étapes de micropipetage, ce qui peut constituer une grave source d'erreur. Le plus grand avantage des méthodes basées sur l'ADN est que des milieux non sélectifs peuvent être utilisés pour l'étape d'enrichissement grâce à la grande sensibilité de la méthode. Les milieux non sélectifs sont abordables, disponibles auprès de différents fournisseurs et nécessitent le niveau de biosécurité le plus bas (niveau 1). Il est également possible de détecter de faibles quantités d'agents pathogènes sur les surfaces environnementales sans enrichissement avec des méthodes basées sur l'ADN, mais la sensibilité est faible par rapport à celle des méthodes basées sur l'enrichissement. Enfin, les résultats faussement positifs obtenus à partir de fragments d'ADN provenant d'agents pathogènes qui ont déjà été tués peuvent constituer un problème majeur.

Méthodes immunologiques

Les immunodosages sont des systèmes qui utilisent des anticorps pour détecter la présence de micro-organismes dans des solutions. Ces anticorps peuvent se lier à des antigènes, tels que les lipopolysaccharides présents à la surface des cellules ou des flagelles de certains micro-organismes. Après une procédure d'enrichissement unique ou multiple comprenant des milieux sélectifs, les pathogènes tels que les cellules Listeria sont détectés à l'aide de systèmes de test basés sur des anticorps spécifiques. Les tests ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) ont été les premiers à utiliser la technologie immunologique pour détecter des micro-organismes spécifiques. L'ELISA permet de quantifier l'analyte détecté, mais la nécessité d'inclure une étape d'enrichissement empêche tout calcul de la concentration initiale. Seul un personnel qualifié peut effectuer les multiples étapes de transfert et de lavage que nécessitent les ELISA. Le développement des dispositifs à flux latéral, également connus sous le nom de tests en bandelettes, a résolu ce problème, rendant la procédure de détection immunologique beaucoup plus facile et rapide et éliminant la charge de travail des tests ELISA. Les dispositifs à flux latéral avec anticorps sélectifs utilisés en combinaison avec des milieux d'enrichissement très performants permettent d'obtenir des résultats rapides et précis sans avoir besoin d'équipements coûteux ou de coûts liés à la formation.

Conclusion

Il n'est pas toujours facile de choisir la bonne technologie de test d'hygiène. Plusieurs considérations pratiques influenceront la décision : combien de sites d'échantillonnage doivent être testés et quelle est l'importance du débit des tests ? Comment les testeurs peuvent-ils optimiser le délai d'obtention des résultats, étant donné que la recherche de certaines bactéries pathogènes n'est pas effectuée tous les jours et qu'il s'agit davantage d'une tâche de surveillance que d'une procédure de contrôle de la qualité ? Des résultats quantitatifs sont-ils nécessaires ou les tests de présence/absence sont-ils suffisants ? Étant donné qu'il n'est toujours pas possible d'obtenir une numération bactérienne immédiatement après le nettoyage, les producteurs peuvent s'appuyer sur des systèmes de test basés sur l'ATP ou les protéines, qui peuvent servir d'indicateur vague pour savoir s'il est sûr de commencer la production, c'est-à-dire s'il y a présence d'ATP ou de protéines. Les réglementations nationales peuvent également influencer cette décision. Les méthodes immunologiques ou d'ADN basées sur l'enrichissement sont supérieures aux autres méthodes en termes de sensibilité et de sélectivité et devraient être les systèmes de choix pour la détection des pathogènes. Pour la détection et le comptage des organismes indicateurs ou le contrôle de l'hygiène générale, des systèmes plus abordables tels que les dip-slides ou les systèmes ATP peuvent être utilisés.