7 coisas que precisa absolutamente de saber sobre materiais de referência para micotoxinas

Os materiais de referência qualificados são um pré-requisito para uma qualificação e quantificação bem sucedidas em química analítica. Mas como é que eles são feitos? Como pode ter a certeza de que cumprem os padrões de qualidade de que o seu laboratório necessita? O que são materiais de referência certificados? Como é que dá sentido ao certificado? Helmut Rost, da Romer Labs, responde a estas e outras perguntas comuns.

1. Porque é que precisamos de materiais de referência?

A resposta curta é que os organismos reguladores e certificadores exigem ou recomendam que os laboratórios os utilizem. Os Estados Unidos e a União Europeia1, por exemplo, regulamentam várias micotoxinas, estabelecendo níveis máximos para esses contaminantes em alimentos para animais e géneros alimentícios. Além disso, os laboratórios acreditados de acordo com a norma ISO 17025 devem utilizar materiais de referência qualificados e competentes para manter a sua acreditação.

A resposta um pouco mais longa é que os laboratórios utilizam materiais de referência para aumentar a fiabilidade dos seus resultados. Nas últimas décadas, a análise de contaminantes como as micotoxinas tem-se tornado cada vez mais importante para a caraterização e avaliação de amostras de alimentos para consumo humano e animal. Os materiais de referência são substâncias com características definidas, como a aflatoxina B1 dissolvida em acetonitrilo a uma concentração de 2 µg/mL. As características específicas de um material de referência - e, mais importante ainda, a sua pureza relativa - fornecem uma referência através da qual os técnicos de laboratório podem confirmar a exatidão dos seus próprios resultados.

2. Como se define um material de referência?

Um material de referência é suficientemente homogéneo e estável no que diz respeito à sua propriedade especificada; por exemplo, tem uma certa percentagem de pureza de uma micotoxina ou micotoxinas como um sólido ou uma certa concentração como um padrão líquido. Estas qualidades garantem a sua aptidão para ser utilizado no processo de medição. Os produtores de materiais de referência que cumprem os requisitos da norma ISO 17034:2016 ("Requisitos gerais para a competência dos produtores de materiais de referência") são considerados competentes. O texto da norma ISO enumera os requisitos correspondentes em várias dezenas de páginas, juntamente com literatura adicional.

Em resumo, o material candidato deve ser bem caracterizado em termos de identidade e pureza antes de poder ser empregue como iniciador de qualquer material de referência. Um plano de produção assegura a documentação correcta de todos os lotes produzidos. Os testes de estabilidade a longo e curto prazo a diferentes temperaturas devem provar que o material é estável até à data de validade especificada. Um teste de homogeneidade para cada lote confirma que o material está distribuído uniformemente pelos recipientes de expedição. Todas as análises têm de cumprir os requisitos da norma ISO 17025; uma acreditação ISO 17034 significa que o laboratório está acreditado de acordo com a norma ISO 17025 no que respeita aos seus métodos analíticos.

3. Como são produzidos os materiais de referência para a análise de micotoxinas?

A maioria das micotoxinas é produzida por três géneros de fungos: Aspergillus, Penicillium e Fusarium. Um material de suporte é inoculado com uma suspensão de fungos e incubado durante várias semanas. São recolhidas amostras durante o processo de fermentação para confirmar que a micotoxina alvo está a ser criada. Os rendimentos típicos do processo de produção são vários gramas de micotoxina bruta por kg de material de suporte e podem variar significativamente dependendo da micotoxina e do processo de fermentação em questão.

Uma vez concluída a incubação, começa o verdadeiro trabalho: o engenheiro de laboratório purifica o extrato bruto muito cru. Começa com processos de filtragem e extracções líquido-líquido para reduzir o peso e o volume do extrato e para remover as principais impurezas. O processo-chave da limpeza consiste em etapas de purificação cromatográfica (semi-)preparativa, nas quais as impurezas e os subprodutos são separados do produto principal devido a um comportamento de adsorção diferente na coluna cromatográfica. Este trabalho exige um elevado grau de competência e experiência, uma vez que cada micotoxina tem as suas próprias propriedades e comportamento de retenção. A limpeza termina com a secagem do produto, pesando-o e verificando novamente a sua qualidade.

Uma utilização específica dos materiais de referência é a de materiais de referência matriciais (ou materiais de controlo de qualidade), que consistem principalmente numa matriz de alimentos para consumo humano ou animal contaminada por micotoxinas naturalmente incorridas. Um exemplo é o milho com desoxinivalenol. Estes materiais podem ser utilizados como controlo de qualidade para apoiar a análise de amostras específicas de alimentos para consumo humano e animal.

4. Porque é que faz sentido utilizar materiais de referência marcados com isótopos para as micotoxinas?

Os analistas que utilizam a espetrometria de massa atribuem uma grande importância aos materiais de referência marcados com isótopos - com razão. Pense neles como "super materiais de referência" para a espetrometria de massa. Podem fazer o que os materiais não marcados com isótopos podem fazer e muito mais. Por exemplo, compensam efeitos indesejáveis, como a diminuição da eficiência de extração, a baixa recuperação ou o comportamento da matriz na análise dos analitos; consequentemente, são essenciais na configuração de qualquer procedimento analítico. Os materiais de referência marcados com isótopos são produzidos como descrito acima, com uma diferença importante: os átomos de 12C são substituídos por átomos de 13C. Por conseguinte, os produtos marcados com isótopos têm o mesmo comportamento físico e químico que as substâncias a analisar não marcadas. São adicionados antes da análise e submetidos ao mesmo procedimento, mas compensam qualquer sobrestimação ou subestimação das micotoxinas não marcadas.

5. Como é que verifica a qualidade dos materiais de referência?

A pureza, ou seja, a qualidade do produto, é de extrema importância e deve ser tão elevada quanto possível, ou superior a 95%. Enquanto os produtos recorrentes podem ser comparados com o lote precursor para verificar a sua qualidade, um novo produto deve ser sujeito a uma caraterização muito mais abrangente. Este tipo de caraterização para os materiais sólidos pode envolver vários métodos altamente selectivos e sensíveis: a determinação da estrutura por espetrometria de massa, espetroscopia de infravermelhos ou espetroscopia de ressonância magnética nuclear pode informar-nos sobre eventuais impurezas inerentes.

Em todo o caso, a pureza deve ser determinada com a maior exatidão e precisão possível. A disponibilidade de um material de referência certificado pode ser uma enorme vantagem, uma vez que torna possível rastrear diretamente o seu próprio material de referência (ver número 6 abaixo). Atualmente, o método padrão para determinar a quantidade de materiais de referência líquidos de micotoxinas (materiais sólidos dissolvidos num solvente) é a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ligada a um detetor apropriado, como o UV (ultravioleta) ou FLD (deteção de fluorescência). Este método tem uma aplicabilidade quase universal, uma vez que a maioria das micotoxinas é sensível ao UV/FLD.

Nas substâncias marcadas com isótopos, a proporção de 13C em relação a 12C (também conhecida como padrão isotópico) pode ser determinada através de uma análise de resolução melhorada com um espetrómetro de massa; a pureza isotópica do 13C deve ser superior a 98%.

Os laboratórios que determinam a propriedade de um material de referência devem ser acreditados de acordo com a norma ISO 17025 ("Requisitos gerais para a competência dos laboratórios de ensaio e calibração"). Uma vez que os laboratórios certificados de acordo com a norma ISO 17025 cumprem o requisito de rastreabilidade metrológica, os seus resultados podem ser utilizados para especificar um material de referência certificado.

6. O que é um material de referência certificado?

Aqui, chegamos ao mais alto nível de normalização. Um material de referência certificado é caracterizado por um procedimento metrologicamente válido para a sua propriedade (como % de pureza ou concentração) e é acompanhado por um certificado que fornece o valor certificado juntamente com a incerteza calculada deste valor. O que isto significa é que existem diferenças entre materiais de referência e materiais de referência certificados em termos de rastreabilidade e incerteza. No trabalho quotidiano de um laboratório, os materiais de referência são normalmente utilizados. Se um material de referência precisar de ser rastreado, o material de referência certificado, com a sua rastreabilidade metrológica, pode ser utilizado como referência. No entanto, atualmente só existem materiais de referência certificados para algumas micotoxinas.

7. Como é que lê o certificado?

Um certificado qualificado fornece as informações necessárias sobre o material de referência. Normalmente, inclui a descrição do produto com o número de lote e a data de validade, o fornecedor com o endereço, o aviso de perigo, a utilização prevista, as instruções para uma utilização correcta, as condições de armazenamento e, mais importante, o valor de referência.

O prazo de validade aplica-se ao produto não aberto nas condições de armazenamento definidas. Para materiais de referência certificados, o certificado documenta mais algumas características: o valor certificado, o orçamento de incerteza e a discussão da rastreabilidade metrológica. A incerteza é calculada com base em factores como a pureza e a preparação do produto e - se não for negligenciável - a sua estabilidade e homogeneidade (consulte o artigo "Determinadas incertezas" para mais informações sobre o cálculo e a utilização de valores de incerteza). O valor certificado é confirmado por uma análise em que a calibração é efectuada por comparação com um lote de referência do analito-alvo preparado de forma independente.

1 CE n.º 1881/2006.