Para além dos testes de alergénios com base imunológica
A maioria dos kits disponíveis no mercado para testes de alergénios alimentares baseia-se na aplicação de métodos imunológicos, tais como ELISA ou dispositivos de fluxo lateral (testes de tiras). Para efetuar o ELISA, é necessário pessoal treinado, mas podem ser analisadas numerosas amostras em paralelo, utilizando placas de microtitulação de 48 ou 96 poços. Em geral, a análise pode demorar entre 30 minutos e algumas horas. Atualmente, o ELISA é o método mais amplamente aplicado para a deteção e quantificação de alergénios alimentares. No entanto, embora muitas amostras possam ser analisadas ao mesmo tempo, estas amostras só podem ser testadas para um analito.
Limitações a considerar
Devido à elevada especificidade dos anticorpos para apenas uma proteína alergénica em particular e às limitações relacionadas com a tecnologia, tem de ser utilizado um kit separado para cada alergénio. Além disso, o elevado grau de especificidade para um alergénio pode levar a resultados falsos negativos. As etapas de processamento dos alimentos, como o tratamento térmico, a adição de compostos ácidos ou a fermentação, podem modificar a estrutura da proteína alvo. Estes alergénios modificados podem perder as suas propriedades imunológicas e o complexo anticorpo - proteína alvo já não pode ser formado. Isto conduz a resultados falsos negativos ou a quantificações reduzidas. Os testes de tiras são baratos, muito fáceis de utilizar, não requerem equipamento de laboratório e dão resultados geralmente em poucos minutos. No entanto, a maioria dos testes de tiras são apenas qualitativos e baseiam-se em anticorpos como elementos de reconhecimento. Por conseguinte, sofrem dos mesmos problemas que os testes ELISA com alimentos altamente processados. Nos últimos anos, foram criados métodos de análise alternativos para ultrapassar, pelo menos, algumas das restrições dos sistemas de testes imunológicos.
Deteção de alergénios com ADN
A PCR (reação em cadeia da polimerase) é um método relativamente rápido e barato para identificar o ADN. Esta tecnologia, desenvolvida na década de 1980, tem vindo a melhorar continuamente desde então. A PCR tem sido utilizada há muitos anos nos domínios do diagnóstico médico, forense, monitorização ambiental e quantificação de organismos geneticamente modificados em alimentos para consumo humano e animal. No início dos anos 2000, a PCR foi aplicada pela primeira vez para identificar o ADN de alergénios alimentares comuns, como a avelã e o amendoim. Até à data, foram publicados ensaios de PCR para a maioria dos "oito grandes" alergénios alimentares dos EUA e para os 14 alergénios alimentares da UE. A PCR amplifica pequenos fragmentos de um ADN alvo até se obter um número suficiente de cópias para visualização ou quantificação. Ao multiplicar o alvo analítico por um fator de 107 a 109, as poucas moléculas de ADN do alergénio obtidas podem ser suficientes para a deteção bem sucedida de ingredientes alergénicos. Inicialmente desenvolvida como um método qualitativo, a PCR foi posteriormente modificada para se tornar uma ferramenta de análise quantitativa através da aplicação de diferentes corantes ou sondas fluorescentes. O facto de a PCR detetar a molécula de ADN extremamente estável pode ser uma vantagem na análise de alimentos altamente processados. O ADN tende a não ser afetado mesmo por condições extremas e pode, portanto, ser detectado mesmo quando a maioria das proteínas já foi degradada ou modificada de alguma forma. Além disso, a PCR pode ser utilizada para alergénios como o aipo, que não podem ser detectados por anticorpos. O aipo tem de ser rotulado na UE mas, até agora, todas as tentativas de produzir anticorpos fiáveis falharam devido à estreita relação entre o aipo e outras plantas como a salsa, a cenoura, os coentros ou o funcho. Na última década, foram desenvolvidas novas técnicas de deteção de ADN. Todos os chamados métodos de amplificação isotérmica estão de alguma forma relacionados com a PCR convencional, mas podem ser efectuados quase sem qualquer instrumentação. É utilizado um simples bloco de aquecimento para amplificar o ADN alvo e a subsequente deteção visual é efectuada através de corantes fluorescentes. A amplificação isotérmica é geralmente mais rápida do que a PCR e menos suscetível a quaisquer impurezas co-isoladas e, em muitos casos, ainda mais sensível.
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Alergénios alimentares
Este artigo foi publicado na Spot On #2
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Porque é que as técnicas de ADN podem falhar
Embora a deteção do ADN de compostos alimentares alergénicos possa ter algumas vantagens sobre os métodos baseados em imunologia, esta abordagem sofre de alguns inconvenientes graves. Uma vez que o ADN é o analito de eleição para a PCR, é difícil/impossível discriminar entre o ovo ou o leite e o ADN do tecido correspondente da galinha ou da vaca, uma vez que partilham ADN idêntico. Algumas amostras, como a clara de ovo ou o leite, contêm apenas pequenas quantidades de ADN, mas muitas proteínas alergénicas, pelo que este método não é adequado para analisar esse tipo de amostras.
Espectrometria de massa: uma tecnologia de ponta
Uma tecnologia ainda mais recente para a deteção e quantificação de alergénios é a espetrometria de massa, um método de alta tecnologia que identifica proteínas e péptidos com um nível de precisão muito elevado. As primeiras tentativas de aplicar esta tecnologia à deteção de alergénios começaram no final dos anos 90, mas a maioria dos resultados só foi publicada nos últimos anos. A principal vantagem da utilização desta tecnologia para a análise de alergénios é o elevado nível de confiança e fiabilidade. Os instrumentos têm a capacidade de detetar múltiplos péptidos por proteína. Idealmente, são analisados dois a três fragmentos de péptidos por alergénio. A vantagem desta abordagem é que, mesmo que as proteínas estejam parcialmente degradadas ou modificadas devido a condições adversas de processamento de alimentos, a probabilidade de encontrar pelo menos um fragmento intacto é bastante elevada. Estes péptidos marcadores são seleccionados a partir de bases de dados ou da literatura e devem ser altamente específicos para os alergénios a quantificar. Além disso, são seleccionados para serem resistentes a alterações no processamento dos alimentos. Esta estratégia de reconhecimento de múltiplos péptidos do alergénio não é possível com ensaios baseados em imunologia. Os anticorpos ligam-se normalmente apenas a um fragmento específico (imunogénico) do alergénio. Se este pequeno fragmento for modificado, o reconhecimento do alvo pode ser prejudicado. Além disso, a espetrometria de massa é capaz de medir vários alergénios em paralelo. Estes métodos multi-analíticos tornaram-se particularmente populares nos últimos anos. Esta estratégia inovadora permite que uma única extração de uma amostra seja analisada em relação a vários alergénios num único ciclo de análise. O procedimento de extração para análise por espetrometria de massa é mais trabalhoso do que para outras abordagens. Primeiro, a amostra é misturada com um tampão de extração que contém frequentemente ditiotreitol ou ureia para criar um ambiente redutor que quebra as ligações dissulfureto das proteínas. O restante resíduo da amostra é então removido por centrifugação e as proteínas linearizadas são clivadas com enzimas de digestão. São necessárias algumas horas ou uma noite para cortar as proteínas alergénicas com estas enzimas em pequenos fragmentos de péptidos. Embora os passos preparatórios sejam demorados, a solução peptídica resultante pode então ser analisada para vários alergénios em paralelo utilizando o espetrómetro de massa. Os actuais métodos múltiplos podem quantificar até sete alergénios em paralelo, mas é de esperar que este número aumente drasticamente nos próximos anos. Os métodos de análise múltipla de micotoxinas começaram com apenas alguns analitos há cerca de 10 anos e, atualmente, as concepções de ensaio mais avançadas são capazes de analisar mais de 400 toxinas em paralelo.
O melhor método?
A espetrometria de massa pode provavelmente ser considerada o método de análise de alergénios com maior potencial para melhorias futuras devido à sua extraordinária fiabilidade, sensibilidade e potencial para realizar análises multi-alergénios.
No entanto, não existe uma abordagem sem inconvenientes. A espetrometria de massa necessita de pessoal altamente qualificado e os custos de investimento inicial são elevados devido à instrumentação dispendiosa. Além disso, o tempo necessário para obter resultados será sempre muito mais longo do que para os métodos imunológicos.
Não existe um método único para todos
Não existe o método perfeito, um padrão de ouro para a quantificação de alergénios. Os métodos ELISA e LFD são os métodos de eleição para a maioria das aplicações industriais. Os resultados podem ser obtidos de forma relativamente rápida, os custos são moderados a baixos e o pessoal pode ser facilmente treinado para utilizar estes testes. Para alguns problemas, como material de ensaio altamente processado ou analitos específicos, a PCR pode conduzir a melhores resultados. A espetrometria de massa situa-se na extremidade superior das tecnologias disponíveis, mas ainda está a dar os primeiros passos na análise de alergénios. No entanto, nos últimos anos, tornou-se o método de eleição para muitos outros desafios analíticos. É de esperar que, num futuro próximo, esta tecnologia possa sofrer um impulso no domínio da análise de alergénios.