Desafios na análise de alergénios - adição de picos e recuperações

Quando comecei a desenvolver imunoensaios para a deteção de alergénios em alimentos, a primeira coisa que me chamou a atenção foi a vasta gama de diferentes tipos de alimentos ou matrizes com que os ensaios tinham de trabalhar. Vindo de uma experiência de imunoensaio médico, havia um número limitado de matrizes diferentes com que trabalhar. No meu caso, tratava-se de soro sanguíneo. Com os alimentos existe uma gama quase infinita de diferentes tipos de amostras, cada uma com as suas próprias propriedades específicas.

Como é que escolho o kit de teste correto?

Então, como é que garantimos que o kit de teste produzido é adequado para utilização com uma gama de amostras tão diversa e exigente? É aqui que entra a validação da amostra. O processo envolve a adição de uma quantidade conhecida de um alergénio de interesse à nossa matriz (pico) e, em seguida, a tentativa de retirar novamente esse alergénio (recuperação). Um aspeto importante a ter em conta é que, tal como o nome indica, os imunoensaios utilizam componentes biológicos (anticorpos) para conseguir a deteção das proteínas alergénicas de interesse. Como em todos os sistemas biológicos, os kits são sensíveis a extremos. No caso dos alimentos, os kits podem não funcionar como deveriam na presença de ácidos ou álcalis fortes, muito sal, muita gordura, etc. Muitos destes extremos podem ser contrariados durante o processo de extração. Por conseguinte, os kits utilizam um sistema tamponado para lidar com as alterações de pH e a adição do tampão à amostra ajuda a reduzir e a diluir alguns dos outros problemas, como o sal e a gordura.

A minha recuperação é aceitável?

Quando se trata da recuperação de uma quantidade conhecida de alergénio a partir de uma matriz de amostra, o que é considerado aceitável? Antes de responder a esta questão, temos de definir o ponto de partida. Trata-se de uma amostra incorrida ou de uma amostra com pico?

As amostras incorridas são definidas como amostras nas quais uma quantidade conhecida do alergénio alimentar foi incorporada durante o processamento, imitando o mais próximo possível as condições reais sob as quais a matriz da amostra seria normalmente fabricada.

O assunto das amostras incorridas será discutido em maior profundidade numa edição posterior da Spot On. Neste artigo, concentrar-me-ei em delinear um método mais acessível de introduzir uma quantidade conhecida de alergénio numa matriz tal como recebida do fornecedor ou fabricante e medir a sua recuperação.

No que diz respeito à recuperação, a orientação afirma que:

"Os níveis ideais de recuperação percentual variam de 80 a 120%. Os níveis de recuperação são afectados tanto pela eficiência da etapa de extração como pelo procedimento ELISA.

"Com os métodos ELISA para alergénios alimentares, este nível de recuperação nem sempre é possível, particularmente quando se analisam determinadas matrizes difíceis. Para além disso, a recuperação a partir de amostras incorridas pode ser substancialmente diferente da obtida com amostras adicionadas.

"Por este motivo, as recuperações entre 50 e 150% serão consideradas aceitáveis, desde que se possa demonstrar que são consistentes."

As directrizes foram publicadas em 2010 pela Associação das Comunidades Analíticas (AOAC) com referência particular aos métodos quantitativos ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Muitos dos pontos-chave são também aplicáveis a métodos qualitativos ou semi-quantitativos LFD (Dispositivo de Fluxo Lateral).

A "ciência" por detrás da dosagem

Quando recebemos ou nos deparamos com um novo tipo de alimento que não foi testado anteriormente, efectuamos uma validação de recuperação de picos para garantir que funciona como deveria com os nossos kits de teste. Iremos aplicar um pico em três níveis diferentes de alergénio - baixo, médio e alto - para cobrir a gama de deteção do ensaio.

O pico de alergénio baixo estará próximo do Limite Inferior de Quantificação, LLOQ, do ELISA (neste caso, o calibrador de valor mais baixo acima de 0 ppm) ou próximo do Limite de Deteção, LOD, de um dispositivo de fluxo lateral. O pico médio situar-se-á a meio da curva de calibração ELISA e o pico alto estará no limite superior de quantificação, ULOQ (o calibrador de valor mais elevado em ppm) ou próximo deste. A amostra é extraída e testada de acordo com o folheto informativo fornecido com o kit.

Assim, por exemplo, se adicionarmos 5 ppm de amêndoa ao chocolate, esperamos ver uma recuperação de 4 ppm a 6ppm. Se o resultado estiver fora deste intervalo, então há passos que podem ser dados para ajudar a melhorar a recuperação. Por experiência, o chocolate é uma das matrizes alimentares mais difíceis de testar - está cheio de taninos e outros polifenóis que se podem ligar a qualquer proteína alergénica que possa estar presente e formar complexos insolúveis que são difíceis de extrair.

Estas dificuldades podem ser ultrapassadas através da adição de proteínas adicionais ao tampão de extração. O excesso de proteína liga-se aos polifenóis e torna os alergénios disponíveis para extração. A minha proteína de eleição é a gelatina de peixe, embora possam ser utilizados outros materiais, como o leite em pó, para melhorar a eficiência da extração de alimentos com elevado teor de polifenóis. Se utilizar leite em pó, tenha cuidado para não contaminar o espaço do seu laboratório, especialmente se estiver a efetuar testes de alergénios do leite.

Os Dispositivos de Fluxo Lateral, ou tiras ou varetas, como são por vezes referidos, podem ser validados para a recuperação de picos de forma semelhante a um kit de teste ELISA para alergénios. O que deve ter em atenção ao escolher um nível de pico elevado é que, embora os dispositivos de fluxo lateral sejam capazes de detetar níveis muito elevados de ppm, pode sobrecarregar o dispositivo adicionando demasiado alergénio. Isto pode ocorrer em quantidades superiores a 1% do alimento alergénico.

Manutenção da qualidade e precisão dos testes

Pode ser necessário que um fabricante de kits trabalhe em estreita colaboração com clientes que testam rotineiramente matrizes alimentares difíceis. É importante verificar se o kit está a funcionar como deve e de forma satisfatória para o cliente. Isto pode ser conseguido, como detalhado acima, através da realização de experiências de recuperação de picos de alergénios na matriz problemática.

Em alguns casos, pode ser desejável modificar ou alterar o método padrão do kit para satisfazer as exigências da amostra e/ou do cliente; isto deve ser sempre efectuado com a orientação do fabricante do kit para garantir a qualidade e a reprodutibilidade do kit de teste.