Criação de Calibrantes Líquidos de Micotoxinas: Um olhar nos bastidores

Os materiais de referência, ou calibrantes, descrevem substâncias ou objectos com um ou mais valores de propriedade característicos definidos que são utilizados como medida ou como referência para métodos de medição. Dada a importância da segurança do consumidor para a indústria alimentar humana e animal, os testes de micotoxinas envolvem a utilização de materiais de referência para obter resultados exactos e fiáveis.

Perigo sempre presente

As micotoxinas são metabólitos secundários de fungos que ocorrem naturalmente e são tóxicos para animais e seres humanos. Os fungos crescem no campo e durante o armazenamento. Encontradas em quase todos os produtos agrícolas em todo o mundo, foram identificadas mais de 380 micotoxinas e a toxicidade de cada substância varia muito. As concentrações máximas permitidas pré-determinadas de várias micotoxinas em matérias-primas vegetais como o grão, o trigo, o milho - para citar apenas algumas - obrigaram os produtores de produtos de base a examinar cuidadosamente as suas amostras num laboratório de análises para terem a certeza da qualidade dos seus produtos.

Preparação gravimétrica

Frequentemente, um fungo que cresce em condições óptimas - temperaturas suficientemente quentes, humidade elevada e um substrato adequado - pode produzir micotoxinas. No laboratório, a história de um material de referência começa com a tentativa de ajustar as condições de crescimento artificial de modo a obter rendimentos óptimos de micotoxinas. Isto inclui a utilização de um género fúngico adequado - uma vez que cada fungo produz o seu próprio padrão caraterístico de metabolitos, que pode chegar às várias centenas. A manutenção de estirpes de fungos para produção é crucial. A sua vitalidade e funcionalidade estão constantemente a ser monitorizadas, uma vez que constituem a base de todas as actividades para os processos de produção de material de referência. Os bolores são organismos vivos que podem sofrer mutações ao longo do tempo, ou mesmo degenerar e resultar numa diminuição do rendimento das micotoxinas. Podem formar-se novos metabolitos após um determinado período de armazenamento, o que também pode influenciar imensamente o processo de isolamento. As estirpes devem ser renovadas regularmente para contrariar mutações, impurezas ou outras características indesejáveis.

O primeiro passo, a fermentação, depende de tornar o ambiente do laboratório literalmente o mais saboroso possível para que o fungo promova o seu crescimento. Os meios ideais também variam de estirpe para estirpe, pelo que componentes como sais e minerais são fornecidos como fonte de nutrientes. O fungo é deixado a crescer durante um certo período de tempo - entre alguns dias e algumas semanas - durante o qual metaboliza o seu meio.

Após a conclusão da fermentação e um controlo cuidadoso do processo, a micotoxina é extraída do material de cultura utilizando um solvente orgânico adequado. Dependendo da estrutura molecular, estes podem ser solventes orgânicos polares ou não polares. Durante a fermentação, os bolores produzem, na sua maioria, impurezas para além da toxina de interesse, por exemplo, outros metabolitos, corantes, óleos, etc.

O extrato bruto resultante contém frequentemente muitas impurezas. Durante o isolamento ou purificação, a micotoxina é aproximada passo a passo da pureza pretendida de >98% através de várias aplicações cromatográficas e preparativas com seletividade diferente. Algumas toxinas têm estruturas moleculares favoráveis e podem ser cristalizadas a partir de uma solução supersaturada de solventes orgânicos polares ou apolares. Isto acontece, por exemplo, através do arrefecimento da solução, da evaporação do solvente de cristalização ou da mistura de vários solventes de polaridade diferente. Outras toxinas podem ser transformadas em pó cristalino por liofilização. Através da cristalização, a pureza da toxina é novamente aumentada até se obter a pureza pretendida.

Controlo de qualidade

A HPLC, o fotómetro UV e a HPLC-MS são utilizados para determinar/confirmar a pureza da matéria-prima produzida. Dependendo da toxina, isto pode ser feito, por exemplo, por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em combinação com a Deteção por Conjunto de Díodos, Deteção por Fluorescência ou similar, com Fotómetro UV (análise qualitativa e quantitativa do composto) ou por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência combinada com deteção por espetrometria de massa. A EM é particularmente necessária para a determinação acima descrita da pureza isotópica (por exemplo, > 98% de átomos de 13C) das micotoxinas marcadas com isótopos de 13C. Os materiais de referência para as micotoxinas ocupam uma posição de nicho no mercado. Por conseguinte, é por vezes difícil encontrar substâncias comparativas que estejam comercialmente disponíveis e que possam ser utilizadas para o controlo de processos durante a produção e os controlos de qualidade.

Entrega

Depois de passar o controlo de qualidade final, a micotoxina sólida é liquefeita para ser utilizada como material de referência líquido para micotoxinas. A solução líquida do calibrante é então engarrafada e é criado um certificado de análise, indicando o valor da propriedade e a sua incerteza, que acompanha cada um dos calibrantes.