Citometria de fluxo por impedância e sua utilização na monitorização de ambientes de processamento de alimentos

Utilizar a citometria de fluxo de impedância para contar células e partículas residuais

A citometria de fluxo por impedância deriva da tecnologia subjacente aos contadores de partículas Coulter, que podem dimensionar e contar partículas suspensas em electrólitos com base nas alterações de impedância causadas pela deslocação dos electrólitos pelas partículas. Ao medir várias frequências ao mesmo tempo para cada partícula que passa, a citometria de fluxo por impedância pode discriminar as partículas com base não só no tamanho, mas também nas propriedades eléctricas. Trata-se de uma variante poderosa da citometria de fluxo, uma vez que é muito robusta e pode ser utilizada para avaliar características celulares que, de outro modo, seriam impossíveis de medir sem a utilização de marcadores moleculares, como a integridade da membrana celular. Assim, em vez de um laser, um citómetro de fluxo de impedância utiliza uma corrente alternada, cujas frequências variáveis permitem que o dispositivo detecte, meça o tamanho e conte separadamente as células e outras partículas que se encontram intactas na membrana. Em comparação com outros dispositivos citométricos de fluxo, os citómetros de fluxo de impedância podem ser leves, portáteis e alimentados por bateria, o que lhes permite serem utilizados onde a amostra é recolhida.

Como é que os citómetros de fluxo de impedância distinguem as células de outras partículas?

A citometria de fluxo por impedância tira partido das propriedades electromagnéticas únicas da membrana celular e do citoplasma para distinguir as bactérias de outras partículas. A membrana e o citoplasma de uma célula influenciam o campo elétrico de uma forma diferente das outras partículas na amostra. Um exemplo utilizando partículas metálicas (condutoras), partículas não condutoras e células intactas pode ilustrar este princípio de forma mais clara. Independentemente da frequência do campo elétrico, a condutividade das partículas metálicas permitirá que o campo elétrico passe sem obstáculos. Contrariamente, as partículas não condutoras, como o poliestireno, resistirão ao campo elétrico; a corrente apenas avançará no meio líquido, o que conduz a uma deslocação de volume mensurável, correlacionada com as partículas no canal de fluxo. As células intactas, no entanto, são únicas na medida em que se assemelham tanto a partículas não condutoras como a partículas metálicas, dependendo da frequência do campo elétrico. A baixas frequências, a qualidade isoladora da membrana de uma célula impede que o campo elétrico a penetre, conduzindo ao mesmo tipo de deslocamento que as partículas não condutoras. No entanto, as frequências mais elevadas podem penetrar parcialmente a membrana; como tal, as células são semelhantes em condutividade às partículas metálicas. Os microelectrodos dos citómetros de fluxo de impedância geram campos tanto a baixas como a altas frequências, permitindo que o dispositivo detecte estas alterações na condutividade e resistência e as atribua em números precisos a células intactas ou a outras partículas. O detetor identifica o alvo como uma bactéria com base no grau variável de impedância ou condutividade a estas frequências. O utilizador recebe então contagens separadas de células intactas e de outras partículas.

Como é que a citometria de fluxo de impedância se compara aos métodos culturais?

Os métodos culturais, em particular a utilização de placas de ágar, são a abordagem tradicional para monitorizar o saneamento dos ambientes de processamento de alimentos. No entanto, os métodos culturais, embora bem estabelecidos, têm várias desvantagens relativamente à sua rapidez e alcance. Os métodos culturais são lentos, necessitando de um a dez dias para que as bactérias se desenvolvam em colónias contáveis. Estes métodos medem apenas o que é cultivável sob as condições específicas de um determinado teste; uma espécie ou outro grupo de bactérias pode requerer um ágar específico ou um meio líquido a uma temperatura exacta, grau de luz ou humidade, para mencionar apenas algumas variáveis. Os métodos culturais também não podem afirmar que a medição de todas as bactérias numa amostra é exaustiva. A "anomalia da grande contagem de placas", um enigma bem conhecido em microbiologia, observa que apenas uma pequena fração de bactérias num habitat pode ser recuperada por cultura. As bactérias num estado viável mas não cultivável (VBNC) estão vivas, mas devido a stress, idiossincrasias ou factores ambientais menos que ideais não podem crescer em ágar ou em meios líquidos. Em alguns casos, podem ser cultivadas após a reanimação, um processo que, mais uma vez, é moroso. Algumas bactérias patogénicas, como a E. coli O157, são conhecidas por entrarem num estado VBNC apenas para proliferarem em fases posteriores da cadeia alimentar ou em hospedeiros humanos após a ingestão. Além disso, as bactérias anaeróbias e microaerófilas requerem a ausência de oxigénio ou níveis de oxigénio inferiores aos das condições atmosféricas normais, respetivamente. As bactérias destes grupos que são cultiváveis requerem condições especiais de incubação, o que aumenta o custo dos testes analíticos. Os citómetros de fluxo de impedância contam todas as bactérias que passam através do canal de fluxo, independentemente do seu estado (cultiváveis, VBNC, não cultiváveis, dormentes) ou dos requisitos de crescimento. Esta quantificação direta e imediata alarga o âmbito de um programa de controlo de higiene; as bactérias que não se multiplicam até entrarem em contacto com os alimentos ou potenciais hospedeiros também podem ser alvo da citometria de fluxo por impedância. Também permite tomar medidas imediatas sempre que a limpeza e a desinfeção não correm de acordo com o planeado.