Não são os suspeitos habituais: 5 lacunas no seu programa de monitorização ambiental

Mesmo os programas de monitorização de limpeza e desinfeção mais bem planeados têm os seus pontos cegos. Stefan Widmann analisa mais de perto cinco das mais prováveis - e mais perigosas - lacunas no seu programa de monitorização ambiental e explica o que são, porque se deve preocupar com elas e o que pode fazer a esse respeito.

#1 Microrganismos viáveis mas não cultiváveis (VBNC)

Durante muito tempo, os microbiologistas assumiram que qualquer bactéria que não crescesse num meio de cultura normal estava morta. Investigações posteriores revelaram que existe um terceiro estado para além do cultivável e do morto: viável mas não cultivável (VBNC).

Em geral, as bactérias no estado VBNC não se multiplicam, mas ainda estão vivas, como demonstrado pela sua atividade metabólica. O mais relevante para nós é o facto de poderem tornar-se cultiváveis após a ressuscitação e, assim, proliferar nos alimentos. Além disso, algumas bactérias patogénicas não se desenvolvem na ausência de um hospedeiro e só precisam de sobreviver nos alimentos até à sua ingestão para causar doenças.

Existem muitas razões pelas quais as bactérias podem entrar no estado VBNC; a fome, a incubação fora do intervalo de temperatura ideal para o crescimento, concentrações osmóticas elevadas, níveis de concentração de oxigénio ou exposição à luz branca são apenas algumas das causas. As características específicas da estirpe de bactéria em questão determinam o que faz exatamente com que as bactérias entrem neste estado.

Porque é que se deve preocupar? Algumas bactérias capazes de entrar no estado VBNC são motivo de preocupação para o fabrico de alimentos. Embora ainda não conheçamos todas as espécies de bactérias que se podem tornar VBNC, conhecemos algumas que o fazem; estas contam com organismos indicadores (tais como Klebsiella aerogenes e Klebsiella pneumoniae), adulterantes (tais como Lactobacillus plantarum e Lactococcus lactis) e patogénicos (tais como Salmonella Typhimurium, Campylobacter coli ou Listeria monocytogenes) entre os seus números.

Depois de as termos identificado, temos agora de perguntar se estas bactérias podem voltar a um estado totalmente cultivável e potencialmente patogénico. Durante muito tempo, os microbiologistas não souberam responder a esta questão, uma vez que é difícil separar totalmente as bactérias VBNC das bactérias cultiváveis. Os investigadores resolveram este problema, em parte, utilizando uma abordagem estatística: diluem um elevado número de bactérias VBNC até ao ponto em que é quase impossível a permanência de bactérias cultiváveis. As bactérias são então contadas após um período de tempo definido. Se forem observados elevados graus de crescimento, a única conclusão possível é que as bactérias deixaram o estado VBNC e tornaram-se cultiváveis.

Um outro corolário é que, se puderem voltar a um estado cultivável, também podem voltar a ser patogénicas. Existem exemplos de um fenómeno como este que conduz a surtos. Por exemplo, suspeitou-se da existência de E. coli O157 VBNC num surto no Japão em 1997, uma vez que o número total de E. coli era insignificante e as estirpes shigatoxigénicas como a O157 podiam causar doenças em números muito baixos.

#Bactérias anaeróbias e microaerófilas

As bactérias anaeróbias ou, mais genericamente, os microrganismos anaeróbicos, podem ser divididos em três grupos: obrigatórios, tolerantes ao ar e facultativos. Como os seus nomes indicam, cada um deles tem requisitos especiais relativamente ao ar, ou mais precisamente, ao oxigénio, que os rodeia. Os anaeróbios obrigatórios, como o Clostridioides difficile, são prejudicados pelo oxigénio e morrem pouco tempo depois da exposição. As bactérias tolerantes ao ar, como o Clostridium botulinum, não podem utilizar o oxigénio e não morrem nem crescem na sua presença. Os anaeróbios facultativos podem utilizar o oxigénio, mas não precisam dele para crescer, como é o caso da E. coli. Existe também o grupo de bactérias microaerófilas, como a Campylobacter, que necessitam de algum oxigénio para crescer, embora em quantidades muito menores (1-2%) do que no ar normal, mas que podem ser inibidas em condições aeróbias.

Porque é que se deve preocupar? Várias bactérias patogénicas têm estes requisitos especiais de crescimento. Atualmente, as espécies de Campylobacter termotolerantes são motivo de preocupação para os profissionais de saúde pública. Em média, cada frango está infetado com Campylobacter, o que faz da carne de aves uma das causas mais comuns de intoxicação alimentar. Na UE, as doenças causadas por espécies de Campylobacter ocorrem duas vezes mais do que as causadas por Salmonella. Do grupo dos anaeróbios, uma espécie de Clostridia, como a C. botulinum, é responsável pela doença de origem alimentar conhecida como botulismo, frequentemente transmitida através de alimentos enlatados (isto é, pobres em oxigénio), nos quais a C. botulinum pode desenvolver-se e produzir o composto botulinum, que é tóxico para os seres humanos. Outra espécie de Clostridia, C. perfringens, é a fonte mais comum de intoxicação alimentar nos EUA e no Canadá e causa sintomas como cólicas abdominais e diarreia. O risco de infeção por C. perfringens está especialmente correlacionado com alimentos mantidos ou armazenados em condições quentes durante longos períodos de tempo, o que favorece o seu crescimento para números infecciosos (104 ufc/g).

#3 A Grande Anomalia da Contagem de Placas

Algumas estimativas indicam que apenas 1% das bactérias podem ser cultivadas com os conhecimentos e técnicas de que dispomos atualmente. A "anomalia da grande contagem de placas" é o termo que utilizamos para descrever a observação de que as contagens de células microscópicas são significativamente mais elevadas do que as contagens correspondentes de "unidades formadoras de colónias" em placas de ágar. Alguns exemplos podem ilustrar melhor este fenómeno: enquanto 50% dos microrganismos da flora oral podem ser cultivados em placas de ágar, a maior parte da flora gastrointestinal não pode ser cultivada de todo. As razões para este facto são numerosas, mas a comunidade de organismos que rodeia a espécie em questão, incluindo outras bactérias, bem como plantas e animais, pode desempenhar um papel importante.

Os métodos de contagem de placas aeróbias baseiam-se em meios muito gerais, que não suportam o crescimento da maioria dos grupos de bactérias. Tecnicamente, isto não faz parte da grande anomalia da contagem em placas, uma vez que algumas bactérias são capazes de crescer em placas de ágar especiais em condições especiais (tais como condições anaeróbias ou microaerófilas).

Porque é que se deve preocupar? A anomalia da grande contagem de placas não coloca problemas significativos nos testes diários, uma vez que as contagens de placas aeróbias para microrganismos indicadores são específicas de um determinado ambiente de produção e, como tal, são sempre relativas a uma linha de base estabelecida para esse ambiente de produção. No entanto, os métodos em placa são muito morosos, exigindo um período de incubação de até três dias, dependendo do protocolo em vigor. Existem métodos directos que não requerem um passo de cultivo para contar as bactérias; os microscópios fornecem uma visão abrangente das bactérias, mas também consomem muito tempo. Embora os métodos directos como a citometria de fluxo sejam comuns em instalações de tratamento de água, não são comuns na indústria alimentar.

#4 Bactérias psicrotróficas

As bactérias psicrotróficas podem crescer a temperaturas tão baixas como 0 °C, com temperaturas óptimas e máximas de crescimento acima dos 15 °C. Isto faz com que estes micróbios sejam especialmente problemáticos para géneros alimentícios e bebidas, tais como carne crua e leite armazenados a baixas temperaturas durante longos períodos de tempo. Os grupos psicrotróficos de bactérias mais frequentemente encontrados nos alimentos são os géneros Gram-negativos Pseudomonas, Aeromonas, Achromobacter, Serratia, Alcaligenes, Chromobacterium e Flavobacterium, bem como os géneros Gram-positivos como Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptococcus, Lactobacillus e Microbacteria. Sabe-se também que a Listeria monocytogenes e algumas estirpes de Clostridium botulinum são capazes de proliferar a temperaturas de refrigeração.

Porque é que se deve preocupar? As bactérias psicrotróficas são adulterantes e podem diminuir significativamente a qualidade e o prazo de validade dos alimentos. As instalações de produção e os tanques de armazenamento refrigerados oferecem um ambiente favorável à multiplicação destas espécies de bactérias. No leite refrigerado, por exemplo, a Pseudomonas fluorescens pode produzir tanto proteases como lipases. Assim, as espécies pertencentes ao género Pseudomonas são consideradas como tipicamente responsáveis por dificuldades tecnológicas, uma vez que as proteases e lipases que produzem podem causar a degradação da gordura e das proteínas do leite, dando-lhe uma cor acinzentada e um sabor amargo. As espécies de Pseudomonas são os microrganismos mais frequentemente responsáveis pela deterioração da carne refrigerada armazenada aerobicamente. É bem conhecido que as espécies de Pseudomonas são muito robustas e capazes de suportar condições ambientais de stress que inibiriam o crescimento de outros microrganismos de deterioração. Na carne crua refrigerada e embalada em vácuo, a microflora é dominada, na maioria dos casos, por bactérias psicrotróficas do ácido lático. Além disso, o crescimento de agentes patogénicos durante o armazenamento refrigerado pode levar a doenças graves.

#5 Biofilmes

Os microrganismos são capazes de colonizar superfícies formando uma matriz polimérica na qual podem estar presentes várias espécies microbianas; isto é conhecido como biofilme. As evidências mostram que a capacidade de formar e sobreviver em biofilmes não se restringe a grupos específicos de microorganismos. De facto, a grande maioria das bactérias é capaz de formar biofilmes. Os biofilmes podem, por conseguinte, ser compostos por monoculturas ou por várias espécies diferentes de microrganismos. Alguns investigadores sugeriram que a estrutura complexa dos biofilmes mistos os torna mais estáveis e mais resistentes aos produtos químicos de limpeza. A população inicial que se liga à superfície pode alterar as propriedades dessa superfície, permitindo que as que vêm depois adiram através da associação célula-a-célula; nalguns casos, a ligação de uma segunda espécie pode aumentar a estabilidade da população do biofilme. Por exemplo, estudos demonstram que a L. monocytogenes tem maior probabilidade de aderir ao aço na presença de Pseudomonas.

Porque é que se deve preocupar? Os biofilmes que se formam no equipamento de processamento de alimentos e noutras superfícies em contacto com os alimentos actuam como uma fonte persistente de contaminação, ameaçando a qualidade e segurança geral dos produtos alimentares e podendo resultar em doenças de origem alimentar, bem como em perdas económicas. Sabe-se que os microrganismos de deterioração são responsáveis por quase um terço das perdas nas cadeias de abastecimento alimentar, tornando a prevenção e o controlo do biofilme uma prioridade na indústria alimentar. Os microrganismos que se formam ou se desenvolvem em biofilmes são mais resistentes à desinfeção, o que os torna problemáticos numa vasta gama de indústrias alimentares. Outros efeitos dos biofilmes, como a corrosão de superfícies metálicas, são uma preocupação crítica adicional nas indústrias alimentares. Em qualquer dos casos, a presença de biofilmes numa fábrica de alimentos põe em risco a saúde humana. O grau de risco depende das espécies bacterianas que formam esta estrutura tridimensional e viva.

Como é que pode colmatar estas lacunas? O potencial da citometria de fluxo Os produtores de alimentos geralmente não têm muitas opções à sua disposição. Aquelas que oferecem um mínimo de precisão, como a coloração vital em combinação com microscópios, podem quantificar as bactérias VBNC, mas são demoradas e requerem equipamento especial. Todos os grupos de bactérias anaeróbias e microaerófilas - com a notável exceção dos anaeróbios facultativos - podem crescer em placas de ágar clássicas, mas apenas sob níveis de oxigénio cuidadosamente controlados.

No entanto, as placas de ágar não são uma panaceia. As placas de ágar só são capazes de contar aproximadamente 1% das espécies conhecidas de bactérias e demoram dias a apresentar resultados - até 10 dias no caso das bactérias psicrotróficas. Os métodos de ATP, embora rápidos, não quantificam as bactérias e têm uma utilidade limitada na deteção de bactérias de biofilmes; os dados cinéticos de células planctónicas livremente suspensas não devem ser utilizados como referência, uma vez que a libertação de ATP é muito menor nos biofilmes. Além disso, os vestígios de ATP provenientes de resíduos alimentares ou de fungos podem facilmente ofuscar o ATP libertado pelas bactérias, uma vez que as células eucarióticas contêm 10 milhões de vezes mais ATP do que as células procarióticas. Por conseguinte, os dispositivos de ATP utilizados para detetar biofilmes tendem a ter um limite de deteção muito mais elevado, o que significa que não são tão sensíveis como seriam na deteção de bactérias que flutuam livremente.

Cada um destes cinco casos mostrou o quão difícil pode ser a deteção de bactérias e resíduos nas superfícies de produção alimentar; as deficiências dos métodos de deteção mais comuns, tais como o plaqueamento e o teste ATP, são tão teimosas como bem documentadas.

O que é que os produtores de alimentos podem fazer para colmatar as lacunas que os métodos culturais e os testes ATP deixam para trás? No próximo artigo, o meu colega Cristian Ilea discute o potencial da citometria de fluxo por impedância e do citómetro de fluxo CytoQuant®, uma nova solução que quantifica imediatamente as bactérias e as partículas de resíduos nas superfícies.