Prevenção de resultados falsos positivos em testes de agentes patogénicos

Os resultados falsos-positivos na deteção de agentes patogénicos podem ser minimizados com fagos que reduzem a ocorrência de bactérias de reação cruzada em testes de agentes patogénicos. As bactérias de reação cruzada podem causar resultados falsos positivos e inibir o crescimento do agente patogénico em questão.

Os resultados falsos positivos causam custos adicionais aos produtores de alimentos, para além do tempo adicional necessário para confirmar os resultados. De acordo com as normas ISO/FDA/USDA, o processo de confirmação dos resultados dos testes começa com a sementeira de placas de ágar selectivas a partir da amostra presumivelmente positiva. Estas placas de ágar devem ser incubadas durante dois dias para comprovar se se trata de uma amostra com resultado positivo real, e incubadas a uma temperatura diferente da das amostras de rotina. Se um laboratório não tiver uma incubadora adicional, a incubadora principal tem de ser posta de lado e ajustada à temperatura necessária, o que significa tempo de inatividade, uma vez que a incubadora não pode ser utilizada para enriquecimentos. Outro aspeto negativo da etapa de confirmação é o facto de as placas de ágar seletivo custarem dinheiro. Como têm um prazo de validade muito limitado, é difícil mantê-las em stock. Em geral, os testes falsos positivos exigem tempo e dinheiro desnecessários.

A questão dos falsos positivos

Podem ocorrer resultados falsos-positivos com qualquer método de deteção de agentes patogénicos. Não importa se se trata de uma tecnologia baseada em ADN, bioquímica ou imunológica. Todos eles lidam com a mesma questão de maior sensibilidade versus maior seletividade. Uma boa abordagem é eliminar as bactérias que reagem de forma cruzada antes da deteção, e os antibióticos são utilizados para este fim. Mas, para a maioria das aplicações, os antibióticos não têm seletividade.

Ultrapassar o desafio da seletividade

Os bacteriófagos (ou fagos) são os organismos mais abundantes no nosso ambiente e estão presentes em grande número na água, nos alimentos e em várias outras fontes. Foram descobertos pelo biólogo canadiano Félix Hubert d'Hérelle em 1917. O seu nome significa "comedores de bactérias", o que de certa forma define o que fazem. Os bacteriófagos têm uma elevada especificidade em relação ao hospedeiro, fixando-se nas bactérias. A grande vantagem da utilização de fagos é o facto de serem inofensivos para os seres humanos, animais e plantas. De facto, os seres humanos são rotineiramente expostos a fagos através do consumo de alimentos ou água, sem efeitos negativos. Os fagos podem ser chamados de "inimigos naturais" das bactérias às quais são específicos. Na carne processada e nos produtos à base de carne, existem cerca de 108 fagos por grama. No trato gastrointestinal humano também estão presentes números elevados de fagos. Antes de os antibióticos estarem amplamente disponíveis, os fagos eram utilizados para tratar infecções bacterianas.

Utilizados durante décadas

A chamada terapia com fagos foi desenvolvida nos EUA e na antiga URSS. Mesmo quando os antibióticos estavam a ser desenvolvidos no mundo ocidental, o antigo bloco soviético continuou a sua investigação sobre a terapia com fagos. Na era pós-guerra fria, as actividades de investigação sobre fagos prosseguiram na Geórgia, onde ainda hoje se realizam. Os fagos têm uma especificidade muito elevada em relação às bactérias hospedeiras, uma caraterística que apresenta aplicações potencialmente interessantes para a alimentação humana e animal, bem como para a indústria biotecnológica. Atualmente, os fagos são utilizados como aditivos para eliminar organismos patogénicos nos alimentos, como instrumento para detetar bactérias ou como suplemento no sistema de meios SELECT™ da Romer Labs, para reduzir ou mesmo eliminar a flora bacteriana competitiva, permitindo que as espécies de bactérias patogénicas alvo cresçam até um nível detetável. São mais selectivos do que os antibióticos, e os micróbios não desenvolvem qualquer resistência a eles.

Identificação de bactérias com reação cruzada

Para identificar fagos, que podem ser utilizados em meios de enriquecimento seletivo ou noutras aplicações para inibir ou mesmo matar bactérias competitivas, a questão-chave é: Como posso começar a encontrá-los? A melhor maneira de começar é olhar para amostras de alimentos ou rações, porque estes materiais de teste contêm bactérias que devem ser inibidas durante o enriquecimento. As estirpes de bactérias que estão distantemente relacionadas com o agente patogénico procurado não são o alvo dos fagos, mas as estirpes que estão intimamente relacionadas com o agente patogénico alvo podem causar resultados falsos positivos.

Transgénico? De modo algum!

Depois de identificadas as bactérias de fundo com reação cruzada, o passo seguinte é procurar um fago que possa atuar contra elas. Os fagos podem ser encontrados em todo o lado, como nos esgotos brutos, nas águas superficiais, nos alimentos e no ambiente agrícola. A forma mais fácil de os extrair, se se tratar de uma matriz vendida, é a centrifugação. Desta forma, os fagos permanecerão no sobrenadante, enquanto outros componentes, como as bactérias, formarão um pellet no fundo do recipiente. Este sobrenadante contém uma mistura heterogénea de diferentes fagos. Em seguida, os diferentes fagos são isolados e o hospedeiro bacteriano que infectam terá de ser determinado. Isto pode ser feito através da técnica denominada "soft agar overly" ou "simple spotting". Nesta técnica, um campo de bactérias é sobreposto a uma placa de ágar tradicional e os sobrenadantes de fagos são espalhados no campo bacteriano. Após uma incubação nocturna, os fagos criam placas (ou zonas de limpeza), visíveis a olho nu. As placas são zonas onde os fagos mataram as bactérias através de uma reação lítica. Agora, os clones de fagos podem ser isolados do ágar, o que significa que são todos cópias da mesma estirpe de fagos.

Como é que os fagos ajudam

Chegou agora a altura de encontrar os melhores fagos para matar bactérias de reação cruzada em enriquecimentos de agentes patogénicos. Isto é conseguido testando os fagos contra as bactérias de reação cruzada, bem como contra o agente patogénico alvo. É preferível um formato de microtitulação para minimizar os custos e acelerar os testes. Uma reação lítica visível num poço indica que o fago é eficaz contra as bactérias. Após vários ensaios laboratoriais, podem finalmente ser identificados os fagos adequados - são fagos que inibem o crescimento de estirpes bacterianas estreitamente relacionadas e que, ao mesmo tempo, não afectam o crescimento do agente patogénico alvo. Estes fagos podem então ser utilizados para eliminar bactérias de reação cruzada em sistemas de teste de deteção de agentes patogénicos, reduzindo a incidência de sinais falsos positivos num programa de monitorização de agentes patogénicos e poupando assim muito dinheiro e tempo.