Tecnologias de testes rápidos de higiene ambiental: Um olhar mais atento

As tecnologias de controlo ambiental habitualmente utilizadas dividem-se em duas abordagens gerais: controlo de resíduos e controlo de microrganismos. Aqui, investigamos as diferentes tecnologias dentro de cada abordagem, como funcionam, e a sua aplicabilidade e vantagens.

Testes de resíduos

Métodos ATP

O trifosfato de adenosina (ATP) é um nucleótido utilizado nas células como uma coenzima para fornecer energia. Pode ser considerado como a "unidade monetária" molecular para a transferência de energia dentro de todas as células vivas. A energia é necessária para todas as actividades celulares, incluindo a síntese de proteínas e membranas, o movimento celular e a divisão celular. A energia é transferida quando o ATP se decompõe em adenosina difosfato e adenosina monofosfato. A hidrólise das ligações covalentes dos fosfatos liberta energia que é utilizada nas reacções.

Os sistemas comerciais de teste de ATP utilizam a reação luciferina/luciferase, que é muito comum na natureza, para gerar luz visível com a energia fornecida pelo ATP. Quanto mais luz é emitida, mais ATP está presente, o que indica mais resíduos alimentares ou mais microrganismos. No entanto, há uma ressalva importante: como estes sistemas são amplamente utilizados para a validação da eficiência da limpeza, os desinfectantes também estão normalmente envolvidos na reação. Estes desinfectantes podem perturbar as paredes celulares dos microrganismos, mas preservam a sua ATP, o que significa que pode não existir uma verdadeira correlação entre os organismos vivos presentes na superfície e os resultados da medição da ATP.

Os métodos de ATP apresentam uma outra desvantagem potencial: a sua aplicabilidade varia consoante o resíduo alimentar a detetar. Por exemplo, os testes de ATP não se prestariam a testar a farinha de trigo, uma vez que se trata de uma matriz altamente processada que deixa pouco ATP nos seus resíduos. Os resíduos de produtos à base de carne, no entanto, contêm níveis elevados de ATP.

Métodos de deteção de proteínas totais

Como outra abordagem de análise de resíduos, os métodos de deteção de proteínas totais não analisam os microrganismos propriamente ditos, mas sim os aminoácidos, péptidos e proteínas. Estes testes são muito rápidos e fornecem resultados num minuto. A deteção não é suficientemente sensível para detetar proteínas de microrganismos unicelulares. Por conseguinte, um resultado negativo com este tipo de teste não indica a ausência do microrganismo. Além disso, não há forma de detetar agentes patogénicos específicos utilizando este método. No entanto, os kits de teste de deteção de proteínas têm a sua utilidade, uma vez que podem dar indicações sobre a eficiência da limpeza de uma forma rápida e económica.

Teste de microrganismos

Métodos culturais cromogénicos

Estes são os métodos tradicionais para monitorizar a higiene do ambiente de processamento. Os métodos culturais são abordados na norma ISO 18593, "Microbiologia da cadeia alimentar - Métodos horizontais para amostragem de superfícies". Podem ser utilizados meios não selectivos e selectivos para detetar organismos específicos.

Métodos baseados em ágar cromogénico

Geralmente, há duas formas de realizar métodos baseados em ágar: direta ou indiretamente através de uma etapa de diluição. Uma das vantagens de ambos é o facto de fornecerem resultados quantitativos.

Nos métodos directos, o ágar das placas ou lâminas de imersão é pressionado diretamente sobre a superfície a ser amostrada. As placas de contacto têm a forma de placas de Petri clássicas e têm normalmente uma área de superfície de 25 cm². As lâminas de imersão são pás de ágar de dupla face protegidas por um tubo de plástico e têm uma superfície de ágar de 7-10 cm² de cada lado da pá, o que equivale a 14-20 cm². Estes sistemas não requerem qualquer equipamento adicional e o processo de amostragem é muito rápido. No entanto, a área de amostragem com este método é limitada.

As zaragatoas, os tecidos e as esponjas são instrumentos de amostragem indireta. Depois de serem esfregados sobre a superfície a testar, são diluídos numa solução tampão, que é depois pipetada para placas de Petri tradicionais e espalhada. A área de superfície testada pode ser muito maior e podem ser testados espaços apertados e lacunas com um método indireto. No entanto, os métodos indirectos têm uma desvantagem: há mais passos de manuseamento e são necessários materiais adicionais. Para a deteção de agentes patogénicos, a norma ISO recomenda uma área de superfície entre 1000 cm² e 3000 cm²; uma área tão grande só pode ser manuseada com esponjas ou panos de esfregaço.

Métodos de deteção baseados em meios líquidos cromogénicos

Este método cultural é utilizado apenas para detetar, mas não para contar, organismos ou grupos de organismos específicos, uma vez que não fornece resultados quantitativos. Nos métodos baseados em meios líquidos, são utilizadas zaragatoas para recolher amostras, que são depois colocadas em tubos cheios de meios selectivos. Em média, a incubação demora pelo menos 48 horas para obter resultados negativos presumíveis. As amostras positivas são identificadas por uma mudança de cor ou florescência num comprimento de onda específico da amostra enriquecida. Estes testes são geralmente fáceis de utilizar e económicos.

A desvantagem dos sistemas baseados em meios líquidos é o seu baixo grau de sensibilidade, resultado de meios altamente selectivos, que suprimem intencionalmente o crescimento de outras bactérias. Existe aqui um certo risco: as bactérias no ambiente de processamento já estão sob stress e podem morrer se os meios de enriquecimento forem demasiado selectivos. Por outro lado, se a seletividade for demasiado baixa, pode ser difícil detetar microrganismos específicos utilizando apenas meios líquidos selectivos. A interpretação dos resultados pode tornar-se difícil e subjectiva, uma vez que a mudança de cor ou a florescência nem sempre é suficientemente forte para indicar um resultado definitivo. A principal vantagem dos métodos baseados em meios líquidos é o facto de serem fáceis de utilizar e acessíveis.

Métodos baseados no ADN

Existem três métodos diferentes baseados no ADN: amplificação isotérmica do ADN, PCR em tempo real e PCR tradicional. A PCR em tempo real é um método estabelecido para a deteção de ADN ou ARN, enquanto a amplificação isotérmica é uma tecnologia mais recente. Existem vantagens claras na utilização da amplificação isotérmica em relação à PCR em tempo real: por exemplo, a amplificação isotérmica não requer um termociclador, uma vez que a reação ocorre a uma temperatura constante. O método baseado no ADN mais rentável, mas também mais trabalhoso, é a PCR tradicional, porque é necessário efetuar uma etapa de hibridação ou utilizar um corante pouco específico após a amplificação para detetar o ADN ou ARN amplificado. Em todos os métodos, partes específicas do ADN ou ARN são reconhecidas por iniciadores específicos e depois multiplicadas pela enzima polimerase. A sensibilidade destes métodos é notavelmente elevada e as regiões-alvo no ADN ou ARN são bem conhecidas. A maior limitação deste sistema é o facto de ser um sistema baseado em enzimas. As enzimas necessitam de soluções tampão específicas para funcionarem corretamente. Os ingredientes dos desinfectantes podem influenciar a atividade das enzimas, o que pode levar a resultados falsos negativos. A tecnologia também requer múltiplos passos de micro-pipetagem, o que pode ser uma fonte séria de erros. A maior vantagem dos métodos baseados no ADN é que podem ser utilizados meios não selectivos para a fase de enriquecimento, graças à elevada sensibilidade do método. Os meios não selectivos são acessíveis, estão disponíveis em vários fornecedores e requerem o nível de biossegurança mais baixo (nível 1). Também é possível detetar pequenas quantidades de agentes patogénicos em superfícies ambientais sem enriquecimento com métodos baseados no ADN, mas a sensibilidade é baixa em comparação com a dos métodos baseados no enriquecimento. Por último, os resultados falsos positivos de fragmentos de ADN de agentes patogénicos que já foram mortos podem constituir um problema grave.

Métodos imunológicos

Os imunoensaios são sistemas que utilizam anticorpos para detetar a presença de microrganismos em soluções. Estes anticorpos podem ligar-se a antigénios, tais como lipopolissacáridos na superfície celular ou flagelos de determinados microrganismos. Após um procedimento de enriquecimento simples ou múltiplo que inclui meios selectivos, os agentes patogénicos, como as células de Listeria, são detectados com sistemas de teste baseados em anticorpos específicos. Os testes ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) foram os primeiros a utilizar a tecnologia imunológica para detetar microrganismos específicos. O ELISA permite a quantificação do analito detectado, mas a necessidade de incluir uma etapa de enriquecimento impede qualquer cálculo da concentração inicial. Apenas pessoal treinado pode efetuar as múltiplas etapas de transferência e lavagem que os ELISA exigem. O desenvolvimento de dispositivos de fluxo lateral, também conhecidos como testes de tira, resolveu este problema, tornando o procedimento de deteção imunológica muito mais fácil e rápido e eliminando a carga de trabalho dos testes ELISA. Os dispositivos de fluxo lateral com anticorpos selectivos utilizados em combinação com meios de enriquecimento de elevado desempenho permitem obter resultados rápidos e precisos sem necessidade de equipamento dispendioso ou de custos relacionados com a formação.

Conclusão

A escolha da tecnologia de testes de higiene correcta nem sempre é uma tarefa fácil. Existem várias considerações práticas que influenciam a decisão: quantos locais de amostragem devem ser testados e qual a importância do rendimento do teste? Como podem os testadores otimizar o tempo até ao resultado, dado que os testes para algumas bactérias patogénicas não são realizados todos os dias e são mais uma tarefa de monitorização do que um procedimento de controlo de qualidade? São necessários resultados quantitativos ou é suficiente o teste de presença/ausência? Uma vez que ainda não é possível obter contagens bacterianas imediatamente após a limpeza, os produtores podem confiar em sistemas de teste baseados em ATP ou proteínas, que podem servir como um indicador vago de que é seguro iniciar a produção, ou seja, se o ATP ou a proteína estão presentes. Além disso, os regulamentos nacionais podem influenciar esta decisão. Os métodos imunológicos ou de ADN baseados no enriquecimento são superiores a outros métodos em termos de sensibilidade e seletividade e devem ser os sistemas de eleição para a deteção de agentes patogénicos. Para a deteção e contagem de organismos indicadores ou para a monitorização da higiene geral, podem ser utilizados sistemas mais económicos, como os dip-slides ou os sistemas ATP.