Revolução ou mera evolução? Citometria de fluxo e verificação da limpeza e desinfeção em instalações de fabrico de alimentos

A segurança alimentar depende em grande parte das condições de higiene nas instalações de fabrico de alimentos. Níveis elevados de bactérias de deterioração podem afetar o prazo de validade e a qualidade dos alimentos, enquanto que a presença de agentes patogénicos (como a Salmonella e a Listeria) pode levar a doenças graves. Os fabricantes de alimentos devem ser diligentes em manter o seu ambiente de processamento limpo e livre de microrganismos patogénicos para evitar a contaminação cruzada do produto final. Mas como é que isto está a ser feito atualmente?

Inspeção visual

Embora a inspeção visual seja um pré-requisito, não é, por si só, suficiente. É um meio subjetivo e impreciso de verificar a limpeza adequada. Mais importante ainda, mesmo que uma superfície não tenha resíduos aparentes, isso não significa que esteja imaculada. A inspeção visual não pode garantir que todos os resíduos alimentares da operação anterior foram limpos ou que um higienizador reduziu eficazmente o nível microbiano na superfície.

Contagem microbiana com métodos baseados em culturas

Estes são os métodos tradicionais para monitorizar a higiene do ambiente de processamento. Geralmente, existem duas formas de realizar a amostragem: por contacto e por esfregaço. Com os métodos baseados no contacto, as placas ou lâminas de imersão são colocadas na superfície a ser amostrada e depois incubadas. A amostragem por esfregaço é efectuada com varetas ou esponjas que são enxaguadas numa solução tampão que é depois inoculada em meios estéreis e incubada. A principal limitação destes métodos tradicionais de determinação microbiana é o tempo que demora a obter resultados. Além disso, a maioria das espécies de bactérias não pode ser cultivada em ágar, um fenómeno conhecido como a anomalia da contagem em placas.

Deteção de ATP

O trifosfato de adenosina (ATP) é um nucleótido que as células utilizam para fornecer energia. Pode ser considerado como a "unidade monetária" molecular para a energia em todas as células vivas. A energia é transferida quando o ATP se decompõe no seu nucleósido e fosfato livre. A hidrólise das ligações covalentes dos fosfatos liberta energia que é utilizada nas reacções. Os sistemas comerciais de teste de ATP utilizam a reação luciferina/luciferase, que é muito comum na natureza, para gerar luz com a energia fornecida pelo ATP. Quanto mais luz é emitida, mais ATP está presente, o que poderia indiretamente indicar mais resíduos alimentares ou (potencialmente) mais microrganismos. No entanto, há uma ressalva importante: uma vez que estes sistemas dependem de uma reação enzimática, potenciais inibidores ou condições ambientais menos que óptimas podem provocar resultados errados. A temperatura ambiente pode aumentar os tempos de reação, enquanto a luz pode dificultar a obtenção de leituras correctas. Além disso, os desinfectantes podem interferir com a reação, o que significa que pode não haver uma correlação real entre as bactérias vivas presentes na superfície e os resultados da medição de ATP. Por conseguinte, os métodos baseados na ATP são normalmente utilizados para testar superfícies antes da aplicação do desinfetante. Os métodos de ATP têm uma outra desvantagem: a sua aplicabilidade depende da natureza dos alimentos que estão a ser processados. A maioria dos alimentos deixa resíduos que contêm grandes quantidades de ATP, que ultrapassam em várias ordens de grandeza as quantidades contidas nas células bacterianas. Na prática, isto significa que os sistemas de ATP não podem ser utilizados para avaliar a contaminação microbiana das superfícies na maioria das instalações de processamento de alimentos. Embora nenhuma bactéria possa ser contada diretamente, os sistemas ATP são amplamente utilizados porque os resultados são gerados em segundos, um tempo de obtenção de resultados que nenhuma outra tecnologia comum conseguiu obter até agora.

Introdução à Citometria de Fluxo

A citometria de fluxo (FCM) refere-se a um grupo de técnicas que utilizam sinais ópticos ou eléctricos para detetar e medir determinadas propriedades físicas ou químicas de células e partículas suspensas num fluido. Cerca de 300 estudos realizados entre 2000 e 2018 avaliaram a FCM como uma ferramenta para caraterizar a qualidade microbiana da água. Esta investigação foi capaz de ilustrar o valor da FCM no tratamento, distribuição e reutilização da água. Existe agora um corpo de investigação que documenta aplicações bem-sucedidas da FCM suficientemente robusto para sugerir que poderia, de forma razoável e realista, ver uma adoção generalizada como um método de rotina para a avaliação da qualidade da água. O que é que tudo isto tem a ver com a avaliação da eficiência da limpeza e desinfeção nas instalações de fabrico de alimentos? Os métodos anteriormente comuns na determinação da qualidade da água eram muitas vezes limitados por uma baixa sensibilidade, elevados requisitos de mão de obra e tempo, suscetibilidade à interferência de compostos inibitórios e dificuldades na distinção entre células viáveis e não viáveis. (Mas tenha cuidado: os citómetros de fluxo de fluorescência são geralmente dispositivos pesados e dispendiosos que requerem pessoal altamente qualificado para funcionar.

Colocar o poder da citometria de fluxo num dispositivo portátil

Para que a FCM seja uma solução viável para a verificação da limpeza em instalações de processamento de alimentos, é necessário que se apresente num formato portátil que seja simples e fácil de utilizar, mas suficientemente preciso para fornecer contagens fiáveis de bactérias e partículas de resíduos em amostras ambientais. Isto foi possível graças à utilização da citometria de fluxo de impedância. A citometria de fluxo por impedância é um tipo específico de citometria de fluxo: em vez de sistemas ópticos, como a tecnologia laser, os citómetros de fluxo por impedância utilizam uma corrente alternada a frequências variáveis que permite ao dispositivo detetar e contar células e partículas residuais separadamente. Enquanto os citómetros de fluxo de base ótica só podem contar células marcadas com corantes, os citómetros de fluxo de impedância podem realizar a mesma operação sem necessidade de marcação. Em comparação com outros dispositivos de citometria de fluxo, são compactos, portáteis e alimentados por bateria, o que lhes permite serem utilizados onde quer que a amostra seja recolhida.

Como podem os citómetros de fluxo de impedância distinguir entre células e partículas de resíduos?

As propriedades electromagnéticas das bactérias permitem aos citómetros de fluxo distingui-las de outras partículas. O citoplasma e a membrana celular de uma bactéria alteram o campo elétrico de formas únicas e identificáveis. Enquanto a corrente eléctrica se move através de partículas metálicas praticamente sem obstáculos, as partículas não condutoras resistem ao campo. As bactérias intactas, no entanto, assemelham-se tanto a partículas não condutoras como condutoras: a membrana celular impede que as baixas frequências a penetrem, fazendo com que se assemelhe a partículas não condutoras; a altas frequências, no entanto, a corrente eléctrica penetra na membrana. Os microelectrodos do citómetro de fluxo de impedância geram estes campos eléctricos e permitem ao aparelho quantificar as alterações da condutividade e da resistência em termos de medições separadas de células intactas e de partículas.

Aplicação da citometria de fluxo por impedância à segurança alimentar: introdução do CytoQuant®

Como mencionado acima, uma vantagem que os citómetros de fluxo de impedância têm sobre outros tipos de dispositivos citométricos é a sua portabilidade. Leves, pequenos e alimentados por bateria, podem funcionar no terreno e em pontos de controlo críticos onde a higiene é uma preocupação primordial. O citómetro de fluxo de impedância CytoQuant® foi concebido para ser utilizado precisamente nestas áreas, incluindo instalações de produção alimentar e salas limpas. A citometria de fluxo de impedância traz vantagens consideráveis aos produtores de alimentos que procuram verificar a sua segurança alimentar e os seus programas de limpeza: a quantificação rápida e separada de bactérias e partículas de resíduos (que podem servir como um indicador da eficácia da limpeza), a sensibilidade do método e a robustez do kit de esfregaço e do próprio citómetro. O sistema CytoQuant® é fácil de utilizar, uma vez que o dispositivo trata de todo o trabalho, exceto a amostragem. Um teste começa por esfregar uma área predefinida (por exemplo, 20 x 20 cm ou 8 x 8 pol.) da superfície a ser testada. Continua colocando a zaragatoa num tubo que contém uma solução condutora patenteada e, em seguida, agitando o kit de zaragatoa para suspender as bactérias. Ao testar águas de enxaguamento, a amostra é colocada diretamente num frasco vazio, sendo depois adicionadas algumas gotas de solução electrolítica. Depois de misturar a amostra, o utilizador insere o frasco no CytoQuant®. Duas agulhas penetram no fundo do tubo, ligando o líquido ao sistema de fluxo do dispositivo. Em seguida, depois de a solução ser introduzida no sistema de fluxo, passa pelos eléctrodos da célula de fluxo. Após 30 segundos, o dispositivo regista resultados separados para bactérias e partículas e apresenta-os no ecrã.

Revolução ou evolução?

O citómetro de fluxo móvel CytoQuant® permite a verificação imediata, no local, dos procedimentos de limpeza e desinfeção em instalações de produção alimentar ou noutras áreas onde a higiene é crucial. Ao quantificar diretamente as bactérias e as partículas de resíduos nas superfícies sem a influência negativa dos desinfectantes ou da temperatura, oferece vantagens substanciais em relação aos dispositivos ATP, enquanto que o tempo de 30 segundos até ao resultado o torna um reforço perfeito para os programas de higiene que já utilizam métodos culturais. Tendo em conta o enorme potencial da citometria de fluxo por impedância, poderá, a dada altura, vir a ser considerada igual ou mesmo substituir os métodos culturais como padrão na verificação da limpeza. Isto representaria uma verdadeira revolução neste domínio.