Os 7 pecados dos testes de OGM

A utilização de culturas geneticamente modificadas (GM) está a aumentar em todo o mundo. Isto apresenta muitas oportunidades para a indústria agrícola, ao mesmo tempo que traz muitos desafios para a indústria de análise. Um especialista da Romer Labs partilha os seus conhecimentos sobre a análise de culturas geneticamente modificadas para que possa evitar cometer erros comuns no seu laboratório.

1. Identificar o alvo errado

Faça o seu trabalho de casa: este é talvez o hábito mais básico que qualquer cientista pode aprender. Isto é particularmente necessário para os testes de organismos geneticamente modificados (OGM), onde fazer o trabalho de casa significa saber quais os eventos que constituem os seus alvos para que possa evitar falsos positivos e resultados errados. O problema está relacionado com os traços. Um traço é uma proteína derivada de uma modificação genética que confere uma caraterística especial à planta. As modificações genéticas podem estar presentes em diferentes combinações que produzem características semelhantes ou completamente diferentes. Entre os elementos mais populares das modificações genéticas encontram-se os promotores (p35S, FMV), os terminadores (NOSt), os genes que codificam certas características úteis (cp4 epsps, pat, bar, Cry1A e outros) e os genes que codificam marcadores selectivos (NPTII, PMI). Os seus técnicos devem ter em conta muitos factores diferentes para definir o alvo de qualquer análise de OGM. Certifique-se de que tem em conta o território de origem do produto, bem como os eventos possíveis, se estes eventos são autorizados na região em questão e se a planta de interesse tem características biotecnológicas disponíveis comercialmente. Pode ser complicado: por vezes, a modificação existe mas não é autorizada ou plantada em determinadas regiões. No entanto, pode ser amplamente utilizada noutra região. Além disso, tem havido casos de eventos não aprovados que escapam ao confinamento e chegam ao campo.

2. Escolha de um método defeituoso ou insuficiente

Pode ser uma decisão arriscada: qual deve ser o âmbito de qualquer rastreio de OGM? Os laboratórios podem limitar-se a alguns elementos genéticos ou proteínas, ou podem alargar o âmbito a vários eventos ou proteínas, o que pode ser dispendioso. É essencial encontrar o método que se adapte às suas necessidades e que garanta resultados exactos. Os métodos baseados em ADN são demorados e dependem de uma extração de ADN de alta qualidade e de controlos adequados. A variação do número de cópias e a poliploidia também podem causar problemas nas amostras e devem ser tidas em consideração ao efetuar a análise do ADN. Um olhar sobre algumas plantas comuns ilustrará este ponto. No caso da soja, não é suficiente testar apenas os promotores e terminadores, porque apenas alguns dos 15 eventos potenciais da soja contêm estes elementos genéticos comuns. No caso do milho, a história é completamente diferente: o rastreio geral destes elementos é quase totalmente suficiente, porque a maioria dos eventos no milho contém estes elementos. Embora os métodos baseados no ADN sejam dispendiosos e utilizados apenas em laboratórios de serviços analíticos, a identificação de proteínas é relativamente barata e é útil no rastreio de características comuns no local. A maioria dos eventos GM tem o seu próprio nível de expressão de proteínas modificadas. Tenha cuidado ao efetuar análises proteicas de soja e canola com as mesmas tiras de dispositivo de fluxo lateral (LFD). A Tabela 1 destaca diferentes taxas de expressão de CP4 EPSPS, tornando necessário o uso de diferentes métodos de deteção de LFD em soja e canola. A abordagem correcta utiliza diferentes testes e ajusta a sensibilidade para diferentes produtos de modo a atingir um nível de deteção semelhante.

3. Não compreender plenamente os diferentes graus de sensibilidade dos testes

Os métodos baseados no ADN são muito sensíveis e são capazes de detetar uma única cópia do gene alvo. A sensibilidade dos métodos baseados no ADN é limitada pelo número de sementes testadas. Normalmente é de 0,01% ou uma semente geneticamente modificada (GM) num conjunto de 10.000 sementes não-GM. Esta sensibilidade é mais do que suficiente para ter 99,9% de certeza de qualquer nível específico de deteção até 0,1%. Por outro lado, os métodos baseados em proteínas têm um limite de deteção (LOD) tão baixo quanto 0,1%, ou 1 semente GM em 1.000 sementes não-GM. No entanto, esta sensibilidade não é suficiente para garantir um resultado com 99% de certeza. O melhor que pode obter com um teste de uma única proteína com um LOD de 0,1% é um nível de 0,46% com 99% de confiança. A distribuição não uniforme das sementes em amostras reais leva a esta discrepância. Para ter 99% de certeza de que o nível de contaminação por OGM é inferior a 0,1%, recomendamos que efectue pelo menos quatro testes de 1.000 grãos com uma sensibilidade de 0,1% cada. Para uma confiança de 95% a 0,1%, efectue três testes de 1000 grãos, todos com resultados negativos.

4. Eliminação de impurezas ou tratamento da amostra

Os laboratórios de cereais removem frequentemente as impurezas das amostras antes de efectuarem um teste. No entanto, a purificação de amostras de OGM não é permitida. Se as amostras contiverem alguns resíduos com vestígios de plantas OGM, estes devem ser detectados. Por exemplo, se uma amostra de milho contiver alguns resíduos de soja OGM (grãos, cascas, pó), a lavagem e a limpeza manual removerão esses resíduos e produzirão um resultado incorreto. Não submeta as amostras a qualquer tipo de tratamento térmico, nem mesmo para secar o excesso de humidade. No caso dos métodos baseados em proteínas, em particular, tal poderia resultar na desnaturação das proteínas de traço e levar à perda total da sensibilidade do teste, uma vez que a proteína alvo teria mudado. Os anticorpos utilizados nestas aplicações deixariam então de ser capazes de reconhecer os seus alvos.

5. Utilizar um procedimento incorreto para preparar a amostra

O seu método de isolamento de ADN deve ser cuidadosamente concebido e seguido para evitar a degradação do ADN, o que poderia distorcer os seus resultados. Por conseguinte, é importante verificar a qualidade e a quantidade de ADN purificado. Para além dos reagentes de extração de ADN utilizados, o método de trituração é também muito importante. Os moinhos de lâminas dão os melhores resultados, uma vez que moem de forma suficientemente fina para permitir a extração de ADN. No entanto, é imperativo limpar cuidadosamente qualquer equipamento de trituração após a utilização, uma vez que a contaminação cruzada é um enorme problema nos testes de OGM. O equipamento que não for corretamente limpo pode produzir resultados falsos negativos em lotes subsequentes. A extração de proteínas requer uma moagem mais grosseira. Basta simplesmente triturar todas as sementes da amostra. Se moer as sementes demasiado finamente, o extrato demorará demasiado tempo a assentar e a amostra conterá demasiadas partículas sólidas, que se colarão aos LFD e inibirão o fluxo do líquido. Os moinhos utilizados para a extração antes da análise de LFD devem ser regulados de modo a evitar a produção de fracções demasiado finas. A forma do recipiente de extração também deve ser tida em conta: não deve ser plana e é preferível utilizar recipientes descartáveis para evitar a contaminação cruzada. Os misturadores são muito utilizados na trituração para a análise de proteínas porque são muito fáceis de limpar, evitando assim problemas de contaminação cruzada.

6. Personalizar os procedimentos de análise ou não ler o folheto informativo

Este pode muito bem ser o pecado mais grave que os operadores cometem. Enquanto os laboratórios de testes de referência empregam pessoal formado durante todo o ano, os laboratórios de cereais têm frequentemente uma política de emprego sazonal e, por conseguinte, empregam pessoal com menos experiência em testes. Isto pode levar a que o procedimento de teste seja mal lido, incorretamente seguido ou alterado no laboratório. Isto pode afetar todas as partes do processo de teste, começando pela extração e afectando elementos de teste como os volumes de líquido necessários para o teste, os tempos de desenvolvimento e os procedimentos de análise. Certifique-se de que lê atentamente toda a embalagem e documentação antes de efetuar qualquer análise, para garantir resultados fiáveis.

7. Limpeza insuficiente do seu equipamento (causando contaminação cruzada)

Certifique-se de que o moinho que utiliza para a análise de OGM é fácil de limpar. A melhor forma de o fazer é utilizar jarros e lâminas amovíveis, para que possa limpá-los separadamente do motor do moinho. Todos os componentes do seu equipamento devem ser laváveis. Os misturadores são normalmente utilizados para triturar amostras de OGM, uma vez que são fáceis de limpar. Os moinhos têm de ser desmontados e todas as peças têm de ser lavadas separadamente. Lave todo o equipamento com sabão líquido e depois enxagúe com água. Não utilize etanol como agente de limpeza; a sua única utilidade é acelerar o processo de secagem. Cada laboratório deve validar o seu procedimento de limpeza para garantir a sua eficácia. Recomendamos a utilização de luvas para o manuseamento de todas as amostras. Mudar as luvas e lavar as mãos entre amostras também ajuda a evitar a contaminação cruzada. Certifique-se de que limpa todas as ferramentas que possam ter entrado em contacto com o extrato de material moído. Outra solução é utilizar equipamento descartável, tanto quanto possível.