Виклики тестування алергенів - Спайки та Відновлення

Коли я почав розробляти імуноаналізи для виявлення алергенів у харчових продуктах, перше, що вразило мене, це широкий діапазон різних типів харчових продуктів або матриць, з якими тест-системи мають працювати. Маючи досвід роботи з медичними імуноаналітами, де було обмежена кількість різних матриць для роботи, у моєму випадку це була сироватка крові. З харчовими продуктами ж існує майже безмежний набір різних типів зразків, кожен з яких має свої специфічні властивості.

Як вибрати правильний тестовий набір?

Отже, як забезпечити, щоб тестовий набір, що виготовляється, був підходящим для використання з таким різноманітним і складним діапазоном зразків? Ось тут і входить в гру валідація зразків. Процес включає додавання відомої кількості алергену до нашої матриці (спайк), а потім намагання знову витягти цей алерген (відновлення).
Важливо пам'ятати, що, як і вказує назва, імуноаналіти використовують біологічні компоненти (антитіла) для досягнення виявлення алергенних білків. Як і всі біологічні системи, тест-системи чутливі до крайнощів.
У випадку з харчовими продуктами тести можуть не працювати так, як повинні, за наявності сильних кислот або лугів, високої концентрації солі, жиру тощо. Багато з цих крайнощів можна компенсувати під час процесу екстракції. Тому набори використовують буферну систему для адаптації до змін pH, а додавання буфера до зразка допомагає знизити та розбавити деякі інші проблеми, такі як сіль і жир.

Чи є моє відновлення прийнятним?

Коли справа доходить до відновлення відомої кількості алергену з матриці зразка, що вважається прийнятним? Перш ніж дати відповідь на це питання, нам потрібно визначити, з чого ми починаємо. Це інкурований зразок чи спайкований?

Інкуровані зразки визначаються як зразки, в які під час обробки було введено відому кількість харчового алергену, що максимально імітує реальні умови, за яких цей зразок зазвичай виробляється.

Тема інкурованих зразків буде детально розглянута в наступному випуску Spot On. У цій статті я зосереджусь на викладенні більш доступного методу спайку відомої кількості алергену в матрицю, отриману від постачальника або виробника, та вимірюванні його відновлення.

Щодо відновлення, то керівні принципи говорять:

"Ідеальні рівні відновлення мають бути в межах від 80 до 120%. Рівень відновлення залежить як від ефективності етапу екстракції, так і від процедури ELISA."

"Методи ELISA для харчових алергенів не завжди дозволяють досягти цього рівня відновлення, особливо коли аналізуються деякі складні матриці. Крім того, відновлення з інкурованих зразків може значно відрізнятися від того, що отримано при використанні спайкованих зразків."

"З цієї причини відновлення в межах від 50 до 150% вважатиметься прийнятним, якщо можна продемонструвати їх сталість."

Ці керівні принципи були опубліковані в 2010 році Асоціацією аналітичних спільнот (AOAC) з особливим акцентом на кількісні методи ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Багато з основних моментів також застосовні до якісних або напівкількісних методів LFD (Lateral Flow Device).

"Наука" за спайком

Коли ми отримуємо або стикаємось з новим типом їжі, який не тестувався раніше, ми проводимо валідацію відновлення спайку, щоб переконатися, що він працює так, як слід, з нашими тестовими наборами. Ми проводимо спайк на трьох різних рівнях алергену - низькому, середньому та високому - щоб охопити діапазон виявлення тесту.

Низький спайк алергену буде близьким до Нижнього межі кількостного вимірювання (LLOQ) ELISA (у цьому випадку найнижчий калібратор вище 0 ppm) або близьким до Межі виявлення (LOD) для пристрою з латеральним потоком. Середній спайк буде в середині калібрувальної кривої ELISA, а високий спайк - на або близько до Верхньої межі кількостного вимірювання (ULOQ) (найвищий калібратор у ppm). Зразок екстрагується і тестується відповідно до інструкції продукту, наданої з набором.

Наприклад, якщо ми додамо 5 ppm мигдалю до шоколаду, ми очікуємо відновлення в межах 4 ppm до 6 ppm. Якщо результат вийде за межі цього діапазону, можна вжити заходів для покращення відновлення. За досвідом, шоколад є однією з найбільш складних харчових матриць для тестування - він містить таніни та інші поліфеноли, які можуть зв'язувати будь-які алергенні білки, що можуть бути присутніми, утворюючи нерозчинні комплекси, які важко екстрагувати.

Такі труднощі можна подолати, додавши додатковий білок до буфера для екстракції. Надлишковий білок зв'язується з поліфенолами і робить алергени доступними для екстракції. Мій вибір білка - рибний желатин, хоча можна використовувати інші матеріали, такі як молочний порошок, для покращення ефективності екстракції з харчових продуктів, що містять багато поліфенолів. Якщо використовуєте молочний порошок, будьте обережні, щоб не забруднити вашу лабораторію, особливо якщо ви проводите тестування на молочні алергени.

Пристрої латерального потоку, або смужки чи дип-стікси, як їх іноді називають, можна валідувати для відновлення спайку так само, як і для набору ELISA для алергенів. Важливо пам'ятати, коли вибираєте високий рівень спайку, що хоча LFD здатні виявляти дуже високі рівні ppm, ви можете фактично перевантажити пристрій, додавши занадто багато алергену. Це може статися при кількості понад 1% алергенного продукту.

Підтримка якості та точності тестів

Може бути необхідним для виробника комплектів тісно співпрацювати з клієнтами, які регулярно тестують складні харчові матриці. Важливо перевірити, чи працює комплект так, як потрібно, і чи задовольняє клієнта. Це можна досягти, як зазначено вище, проводячи експерименти з відновленням алергенів в проблемній матриці.

В деяких випадках може бути бажано змінити або модифікувати стандартний метод комплекту, щоб відповідати вимогам зразка та/або клієнта; це завжди слід робити під керівництвом виробника комплекту, щоб забезпечити якість і відтворюваність тестового комплекту.