7 dolog, amit feltétlenül tudnia kell a mikotoxin referenciaanyagokról

A minősített referenciaanyagok az analitikai kémiában a sikeres minősítés és mennyiségi meghatározás előfeltételei. De hogyan készülnek? Hogyan lehet biztos abban, hogy megfelelnek a laboratóriumának szükséges minőségi előírásoknak? Mik azok a minősített referenciaanyagok? Hogyan lehet értelmet adni a tanúsítványnak? Helmut Rost, a Romer Labs munkatársa válaszol ezekre a gyakori kérdésekre és még sok másra is.

1. Miért van szükségünk referenciaanyagokra?

A rövid válasz az, hogy a szabályozó és tanúsító szervek megkövetelik vagy ajánlják, hogy a laboratóriumok használják őket. Az Egyesült Államok és az Európai Unió1 például egyaránt szabályoz számos mikotoxint azáltal, hogy meghatározza a takarmányokban és élelmiszerekben előforduló szennyező anyagok maximális szintjét. Továbbá az ISO 17025 szerint akkreditált laboratóriumoknak minősített és megfelelő referenciaanyagokat kell használniuk akkreditációjuk fenntartásához.

A kissé hosszabb válasz az, hogy a laboratóriumok referenciaanyagokat használnak, hogy növeljék eredményeik megbízhatóságát. Az elmúlt évtizedekben a szennyező anyagok, például a mikotoxinok elemzése egyre fontosabbá vált az élelmiszer- és takarmányminták jellemzése és értékelése szempontjából. A referenciaanyagok meghatározott tulajdonságokkal rendelkező anyagok, mint például az aflatoxin B1 2 µg/ml koncentrációban acetonitrilben oldva. A referenciaanyag sajátos jellemzői - és ami fontos, relatív tisztasága - olyan viszonyítási alapot biztosítanak, amely alapján a laboratóriumi szakemberek megerősíthetik saját eredményeik pontosságát.

2. Hogyan határozzák meg a referenciaanyagot?

A referenciaanyag a meghatározott tulajdonsága tekintetében kellően homogén és stabil; például szilárd anyagként egy mikotoxin vagy mikotoxinok bizonyos százalékos tisztaságával, vagy folyékony standardként egy bizonyos koncentrációval rendelkezik. Ezek a tulajdonságok biztosítják a mérési folyamatban való felhasználhatóságukat. Az ISO 17034:2016 ("A referenciaanyag-gyártók alkalmasságának általános követelményei") követelményeit teljesítő referenciaanyag-előállítók minősülnek alkalmasnak. Az ISO-szabvány szövege több tucat oldalon keresztül sorolja fel a megfelelő követelményeket, további szakirodalommal együtt.

Összefoglalva, a jelölt anyagnak jól jellemezhetőnek kell lennie az azonosság és a tisztaság szempontjából, mielőtt bármilyen referenciaanyag kiindulási anyagaként alkalmazható lenne. A gyártási terv biztosítja az összes előállított tétel helyes dokumentálását. Különböző hőmérsékleteken végzett hosszú és rövid távú stabilitási vizsgálatoknak kell bizonyítaniuk, hogy az anyag a megadott lejárati időpontig stabil. Minden tétel homogenitási vizsgálata megerősíti, hogy az anyag egyenletesen oszlik el a kiszállító edényekben. Minden elemzésnek meg kell felelnie az ISO 17025 követelményeinek; az ISO 17034 akkreditáció azt jelenti, hogy a laboratórium az ISO 17025 szerint akkreditált analitikai módszerekkel rendelkezik.

3. Hogyan készülnek a mikotoxinelemzéshez használt referenciaanyagok?

A mikotoxinok többségét három gombafaj termeli: Aspergillus, Penicillium és Fusarium. Egy hordozóanyagot beoltanak egy gombaszuszpenzióval, és több héten át inkubálják. Az erjedési folyamat során mintákat vesznek, hogy megerősítsék, hogy a célzott mikotoxin keletkezik. Az előállítási folyamat tipikus hozama néhány gramm nyers mikotoxin/kg hordozóanyag, és jelentősen változhat a mikotoxintól és az adott fermentációs folyamattól függően.

Az inkubáció befejezése után kezdődik az igazi munka: a laboratóriumi mérnök megtisztítja a nagyon nyers nyers nyers kivonatot. Szűrési eljárásokkal és folyadék-folyadék extrakciókkal kezdődik a kivonat tömegének és térfogatának csökkentése és a fő szennyeződések eltávolítása érdekében. A tisztítás kulcsfontosságú folyamata (fél)preparatív kromatográfiás tisztítási lépésekből áll, amelyek során a szennyeződések és melléktermékek a kromatográfiás oszlopon való eltérő adszorpciós viselkedésük miatt elválnak a főterméktől. Ez a munka nagyfokú szakértelmet és tapasztalatot igényel, mivel minden mikotoxinnak saját tulajdonságai és retenciós viselkedése van. A tisztítás a termék szárításával, mérlegelésével, majd ismételt minőségi ellenőrzésével zárul.

A referenciaanyagok egyik speciális felhasználási módja a mátrix referenciaanyagként (vagy minőségellenőrzési anyagként) történő felhasználás, amely főként természetes úton keletkezett mikotoxinokkal szennyezett élelmiszer- vagy takarmánymátrixból áll. Ilyen például a deoxinivalenollal szennyezett kukorica. Ezeket az anyagokat minőségellenőrzésként lehet alkalmazni, hogy támogassák az egyes élelmiszer- és takarmányminták elemzését.

4. Miért van értelme izotópjelzett referenciaanyagokat használni a mikotoxinok esetében?

A tömegspektrometriát alkalmazó elemzők nagy jelentőséget tulajdonítanak az izotópjelzett referenciaanyagoknak - joggal. Gondoljon ezekre úgy, mint a tömegspektrometria "szuper referenciaanyagaira". Képesek arra, amire a nem izotóp-jelölt anyagok, és még ennél is többre. Például kompenzálják az olyan nem kívánt hatásokat, mint a csökkent extrakciós hatékonyság, az alacsony visszanyerés vagy a mátrix viselkedése az analitok elemzése során; következésképpen nélkülözhetetlenek bármely analitikai eljárás beállításakor. Az izotópjelzett referenciaanyagokat a fent leírtak szerint állítják elő, egy fontos különbséggel: a 12C atomokat 13C atomokkal helyettesítik. Ezért az izotópjelzett termékek fizikai és kémiai viselkedése megegyezik a nem jelölt analitokéval. Az analízis előtt adják hozzá őket, és ugyanazon az eljáráson mennek keresztül, de kompenzálják a nem jelölt mikotoxinok esetleges túl- vagy alulbecslését.

5. Hogyan ellenőrzi a referenciaanyagok minőségét?

A tisztaság, azaz a termék minősége kiemelkedő fontosságú, és a lehető legmagasabb, vagy 95%-nál magasabb értéket kell elérnie. Míg a visszatérő termékeket össze lehet hasonlítani a prekurzor tétellel a minőségük ellenőrzése céljából, egy új terméket sokkal átfogóbb jellemzésnek kell alávetni. A szilárd anyagok ilyen jellegű jellemzése több, rendkívül szelektív és érzékeny módszert is magában foglalhat: a szerkezet meghatározása tömegspektrometriával, infravörös spektroszkópiával vagy mágneses magrezonancia spektroszkópiával tájékoztathat bennünket az esetlegesen benne rejlő szennyeződésekről.

A tisztaságot minden esetben a lehető legpontosabban és legpontosabban kell meghatározni. A hitelesített referenciaanyag rendelkezésre állása hatalmas előnyt jelenthet, mivel lehetővé teszi a saját referenciaanyag közvetlen nyomon követését (lásd a 6. pontot). Napjainkban a mikotoxinok folyékony referenciaanyagainak (oldószerben oldott szilárd anyagok) mennyiségének meghatározására a standard módszer a nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC), amelyhez megfelelő detektor, például UV (ultraibolya) vagy FLD (fluoreszcencia detektor) csatlakozik. Ez a módszer szinte univerzálisan alkalmazható, mivel a legtöbb mikotoxin UV/FLD-érzékeny.

Izotópokkal jelölt anyagok esetében a 13C és a 12C aránya (más néven izotópmintázat) tömegspektrométerrel végzett fokozott felbontású vizsgálat segítségével határozható meg; a 13C izotóp tisztaságának 98%-nál nagyobbnak kell lennie.

A referenciaanyag tulajdonságát meghatározó laboratóriumoknak az ISO 17025 ("A vizsgálati és kalibráló laboratóriumok alkalmasságának általános követelményei") szerint akkreditáltnak kell lenniük. Mivel az ISO 17025 szerint tanúsított laboratóriumok teljesítik a metrológiai nyomon követhetőség követelményét, eredményeik felhasználhatók a tanúsított referenciaanyag meghatározásához.

6. Mi az a hitelesített referenciaanyag?

Itt érkezünk el a szabványosítás legmagasabb szintjéhez. A hitelesített referenciaanyagot a tulajdonságára (pl. % tisztaság vagy koncentráció) vonatkozó metrológiai szempontból érvényes eljárás jellemzi, és tanúsítvány kíséri, amely a hitelesített értéket az érték számított bizonytalanságával együtt adja meg. Ez azt jelenti, hogy a referenciaanyagok és a hitelesített referenciaanyagok között a nyomon követhetőség és a bizonytalanság tekintetében különbségek vannak. Egy laboratórium mindennapi munkája során jellemzően referenciaanyagokat használnak. Ha egy referenciaanyagot vissza kell követni, akkor a hitelesített referenciaanyagot a metrológiai nyomon követhetőségével lehet referenciaként használni. Jelenleg azonban csak néhány mikotoxin esetében léteznek hitelesített referenciaanyagok.

7. Hogyan olvassa el a tanúsítványt?

A minősített tanúsítvány tartalmazza a referenciaanyagról szükséges információkat. Jellemzően tartalmazza a termék leírását a tételszámmal és a lejárati idővel, a szállítót a címmel, a veszélyre vonatkozó figyelmeztetést, a rendeltetésszerű használatot, a helyes használatra vonatkozó utasításokat, a tárolási feltételeket és - ami a legfontosabb - a referenciaértéket.

A lejárati idő a bontatlan termékre vonatkozik a meghatározott tárolási feltételek mellett. A hitelesített referenciaanyagok esetében a tanúsítvány néhány további jellemzőt dokumentál: a hitelesített értéket, a bizonytalansági költségvetést és a metrológiai nyomon követhetőség tárgyalását. A bizonytalanságot olyan tényezők alapján számítják ki, mint a termék tisztasága és elkészítése, valamint - ha nem elhanyagolható - stabilitása és homogenitása (a bizonytalansági értékek kiszámításáról és használatáról bővebben lásd az "Egyes bizonytalanságok" című cikket). A hitelesített értéket egy olyan elemzéssel kell megerősíteni, amelyben a kalibrációt a célanalit egy függetlenül előállított referenciatételével szemben végzik el.

1 1881/2006/EK.