Voltar para a Biblioteca Romer
Az immunalapú allergénvizsgálaton túl
A legtöbb kereskedelmi forgalomban kapható, élelmiszer-allergének vizsgálatára szolgáló készlet immunalapú módszerek, például ELISA vagy laterális áramlású eszközök (csíktesztek) alkalmazására épül. Az ELISA elvégzéséhez képzett személyzetre van szükség, de számos minta párhuzamosan elemezhető 48- vagy 96-lyukú mikrotiterlemezek használatával. Az elemzés általában 30 perctől néhány óráig tarthat. Jelenleg az ELISA a legszélesebb körben alkalmazott módszer az élelmiszer-allergének kimutatására és mennyiségi meghatározására. Azonban, bár sok minta elemezhető egyszerre, ezek a minták csak egy analitre vizsgálhatók.
Figyelembe veendő korlátozások
A csak egy adott allergén fehérjére vonatkozó antitestek nagyfokú specifitása és a technológiával kapcsolatos korlátok miatt minden egyes allergénhez külön készletet kell használni. Továbbá az egy allergénre való nagyfokú specifitás hamis negatív eredményekhez vezethet. Az olyan élelmiszer-feldolgozási lépések, mint a hőkezelés, savas vegyületek hozzáadása vagy fermentáció módosíthatják a célfehérje szerkezetét. Ezek a módosított allergének elveszíthetik immunológiai tulajdonságaikat, és az antitest - célfehérje komplex már nem tud kialakulni. Ez hamis negatív eredményekhez vagy csökkentett mennyiségi meghatározáshoz vezet. A csíktesztek olcsók, nagyon könnyen használhatók, nem igényelnek laboratóriumi felszerelést, és általában néhány perc alatt adnak eredményt. A legtöbb szalagteszt azonban csak minőségi, és felismerő elemként antitestekre támaszkodik. Ezért ugyanazokkal a problémákkal küzdenek, mint az ELISA-tesztek a nagymértékben feldolgozott élelmiszerek esetében. Az elmúlt években alternatív vizsgálati módszerek jöttek létre, amelyekkel az immunalapú tesztrendszerek korlátozásait legalább részben le lehet küzdeni.
Az allergének kimutatása DNS-sel
A PCR (polimeráz láncreakció) viszonylag gyors és olcsó módszer a DNS azonosítására. Ez az 1980-as években kifejlesztett technológia azóta folyamatosan fejlődött. A PCR-t már évek óta használják az orvosi diagnosztika, a törvényszéki orvostan, a környezeti monitorozás, valamint az élelmiszerekben és takarmányokban lévő genetikailag módosított szervezetek mennyiségi meghatározása területén. A 2000-es évek elején alkalmazták először a PCR-t az olyan gyakori élelmiszer-allergének DNS-ének azonosítására, mint a mogyoró és a földimogyoró. Mostanáig az amerikai "nyolc nagy" és a 14 uniós élelmiszer-allergénre vonatkozó PCR-próbákat tették közzé. A PCR a cél-DNS kis töredékeit amplifikálja, amíg a vizualizáláshoz vagy a mennyiségi meghatározáshoz elegendő számú másolatot nem kapunk. Az analitikai célpont 107-109-szeresére szorozva az így nyert néhány molekula allergén DNS éppen elegendő lehet az allergén összetevők sikeres kimutatásához. Az eredetileg minőségi módszerként kifejlesztett PCR-t később különböző fluoreszcens generáló festékek vagy szondák alkalmazásával kvantitatív analízis eszközévé módosították. Az a tény, hogy a PCR a rendkívül stabil DNS-molekulát detektálja, előnyt jelenthet a nagymértékben feldolgozott élelmiszerek elemzésekor. A DNS-t még szélsőséges körülmények sem befolyásolják, ezért még akkor is kimutatható, ha a fehérjék többsége már lebomlott vagy valamilyen módon módosult. A PCR továbbá olyan allergénekre is alkalmazható, mint például a zeller, amelyek antitestekkel nem mutathatók ki. A zellert az EU-ban címkézni kell, de eddig a zeller és más növények, mint a petrezselyem, a sárgarépa, a koriander vagy az édeskömény közötti szoros rokonság miatt a megbízható antitestek előállítására tett kísérletek kudarcot vallottak. Az elmúlt évtizedben újabb DNS-kimutatási technikákat fejlesztettek ki. Mindezek az úgynevezett izotermikus amplifikációs módszerek valamilyen módon rokonok a hagyományos PCR-rel, de szinte minden műszer nélkül elvégezhetők. A cél-DNS felerősítésére egy egyszerű fűtőblokkot használnak, az ezt követő vizuális kimutatás pedig fluoreszcens festékekkel történik. Az izotermikus amplifikáció általában gyorsabb, mint a PCR, és kevésbé hajlamos az esetlegesen társult szennyeződésekre, sőt sok esetben még érzékenyebb is.
Publicado em:
Élelmiszer-allergének
Miért vallhatnak kudarcot a DNS-technikák
Bár az allergén élelmiszervegyületek DNS-ének kimutatása bizonyos előnyökkel járhat az immunalapú módszerekkel szemben, ez a megközelítés néhány súlyos hátrányt is rejt magában. Mivel a PCR esetében a DNS a választott analit, nehéz/lehetetlen különbséget tenni a tojás vagy a tej és a csirke vagy a tehén megfelelő szöveti DNS-e között, mivel ezek azonos DNS-t tartalmaznak. Egyes minták, mint például a tojásfehérje vagy a tej csak kis mennyiségű DNS-t, de sok allergén fehérjét tartalmaznak, ezért ez a módszer nem alkalmas az ilyen típusú minták elemzésére.
Tömegspektrometria: csúcstechnológia
Az allergének kimutatására és mennyiségi meghatározására szolgáló még újabb technológia a tömegspektrometria, egy csúcstechnológiás módszer, amely nagyon nagy pontossággal azonosítja a fehérjéket és peptideket. Az első kísérletek e technológia alkalmazására az allergének kimutatására az 1990-es évek végén kezdődtek, de a legtöbb eredményt csak az elmúlt néhány évben publikálták. A technológia allergénvizsgálatra történő alkalmazásának fő előnye a nagyfokú megbízhatóság és megbízhatóság. A műszerek képesek fehérjénként több peptid kimutatására. Ideális esetben allergénenként két-három fragmentum peptidet elemeznek. Ennek a megközelítésnek az az előnye, hogy még akkor is, ha a fehérjék részben lebomlanak vagy módosulnak a kemény élelmiszer-feldolgozási körülmények miatt, elég nagy a valószínűsége annak, hogy legalább egy ép fragmentumot találnak. Ezeket a markerpeptideket adatbázisokból vagy az irodalomból választják ki, és nagyon specifikusnak kell lenniük a számszerűsítendő allergénekre. Továbbá úgy választják ki őket, hogy ellenállóak legyenek az élelmiszer-feldolgozás során bekövetkező változásokkal szemben. Az allergénnek ez a több peptidből álló felismerési stratégiája nem lehetséges az immunalapú vizsgálatokkal. Az antitestek általában az allergénnek csak egy adott (immunogén) fragmentumához kötődnek. Ha ezt a kis fragmentumot módosítják, a célpont felismerése akadályozottá válhat. Ezenkívül a tömegspektrometria több allergén párhuzamos mérésére is képes. Ezek a multianalitikus módszerek különösen népszerűvé váltak az utóbbi években. Ez az innovatív stratégia lehetővé teszi, hogy egy minta egyetlen extrakciójából egyetlen analízisfutás során számos allergénre lehessen szűrni. A tömegspektrometriás elemzéshez szükséges extrakciós eljárás sokkal munkaigényesebb, mint más módszerek esetében. Először a mintát egy gyakran ditiotreitolt vagy karbamidot tartalmazó extrakciós pufferrel keverik össze, hogy redukáló környezetet hozzanak létre, amely felbontja a fehérjék diszulfidkötéseit. A fennmaradó mintamaradékot ezután centrifugálással eltávolítják, majd a linearizált fehérjéket emésztőenzimekkel hasítják. Néhány óra vagy egy éjszakai időtartam szükséges ahhoz, hogy az allergén fehérjéket ezekkel az enzimekkel kis peptidfragmentumokká vágják. Bár a preparatív lépések időigényesek, a kapott peptidoldat ezután párhuzamosan több allergénre is elemezhető tömegspektrométerrel. A jelenlegi multi-módszerek akár hét allergént is képesek párhuzamosan számszerűsíteni, de várhatóan ez a szám a következő években drasztikusan növekedhet. A mikotoxin multianalit módszerek csak néhány analitummal kezdődtek mintegy 10 évvel ezelőtt, és ma már a legfejlettebb vizsgálati tervek több mint 400 toxin párhuzamos elemzésére képesek.
A legjobb módszer?
A tömegspektrometria valószínűleg az allergénvizsgálati módszer, amely a legnagyobb jövőbeli fejlődési potenciállal rendelkezik, mivel kiemelkedő a megbízhatósága, érzékenysége és a több allergénre kiterjedő analízis elvégzésének lehetősége.
Nincs azonban hátrányoktól mentes megközelítés. A tömegspektrometria magasan képzett személyzetet igényel, és a kezdeti beruházási költségek a drága műszerek miatt magasak. Ezenkívül az eredmény eléréséhez szükséges idő mindig sokkal hosszabb, mint az immunológiai módszerek esetében.
Nincs egyméretű megoldás
Tökéletes módszer, az allergén mennyiségi meghatározásának arany standardja nem létezik. Az ipari alkalmazások többségénél az ELISA és az LFD a választott módszer. Viszonylag gyorsan lehet eredményeket kapni, a költségek mérsékeltek vagy alacsonyak, és a személyzet könnyen betanítható e tesztek használatára. Bizonyos problémák, például a nagymértékben feldolgozott vizsgálati anyagok vagy specifikus analitok esetében a PCR jobb eredményekhez vezethet. A tömegspektrometria a rendelkezésre álló technológiák felső határán helyezkedik el, de az allergénvizsgálat terén még gyerekcipőben jár. Az utóbbi években azonban számos más analitikai kihívás esetén is a választott módszerré vált. Várható, hogy ez a technológia a közeljövőben fellendülést tapasztalhat az allergénanalízis területén.