Kihívások az allergénvizsgálat során - Tüskésítés és visszanyerés

Amikor elkezdtem immunpróbákat fejleszteni az élelmiszerekben lévő allergének kimutatására, az első dolog, ami feltűnt nekem, az volt, hogy a különböző élelmiszer-típusok vagy mátrixok széles skáláját kellett a próbáknak feldolgozniuk. Mivel orvosi immunoassay háttérrel rendelkeztem, korlátozott számú különböző mátrixokkal lehetett dolgozni. Az én esetemben ez a vérszérum volt. Az élelmiszerek esetében szinte végtelen számú különböző mintatípus létezik, mindegyiknek megvannak a maga sajátos tulajdonságai.

Hogyan válasszam ki a megfelelő tesztkészletet?

Hogyan biztosíthatjuk tehát, hogy az előállított tesztkészlet alkalmas legyen a minták ilyen változatos és kihívást jelentő skálájával való használatra? Itt jön a képbe a minta validálása. A folyamat során a mátrixunkba ismert mennyiségű, érdeklődésre számot tartó allergént adunk (spike), majd megpróbáljuk azt az allergént újra kiszedni (recovery). Fontos megjegyezni, hogy - ahogy a neve is mutatja - az immunoassayk biológiai komponenseket (antitesteket) használnak az érdeklődésre számot tartó allergén fehérjék kimutatásának eléréséhez. Mint minden biológiai rendszer esetében, a készletek is érzékenyek a szélsőségekre. Élelmiszerek esetében a kitek nem működnek úgy, ahogyan kellene, ha erős sav vagy lúg, magas só- vagy zsírtartalom stb. van jelen. Ezen szélsőségek közül sok ellensúlyozható az extrakciós folyamat során. A kitek ezért pufferelt rendszert használnak a pH-változások kezelésére, és a puffer hozzáadása a mintához segít csökkenteni és hígítani néhány más problémát, például a sót és a zsírt.

Elfogadható a visszanyerésem?

Amikor egy ismert mennyiségű allergén visszanyeréséről van szó egy mintamátrixból, mi tekinthető elfogadhatónak? Mielőtt erre válaszolnánk, meg kell határoznunk, hogy honnan indulunk ki. Ez egy felmerült minta vagy egy tüskésített minta?

A felmerült minták olyan minták, amelyekbe a feldolgozás során ismert mennyiségű élelmiszer-allergént építettek be, a lehető legjobban utánozva azokat a tényleges körülményeket, amelyek között a mintamátrixot általában gyártják.

A keletkezett minták témáját a Spot On egy későbbi számában részletesebben tárgyaljuk. Ebben a cikkben arra fogok koncentrálni, hogy felvázoljak egy könnyebben hozzáférhető módszert, amelynek során ismert mennyiségű allergént juttatunk a beszállítótól vagy gyártótól kapott mátrixba, és mérjük a visszanyerést.

A visszanyerés tekintetében az iránymutatás kimondja, hogy:

"Az ideális százalékos visszanyerési szint 80 és 120% között mozog. A visszanyerési szinteket az extrakciós lépés és az ELISA-eljárás hatékonysága egyaránt befolyásolja.

"Az élelmiszer-allergénekre vonatkozó ELISA-módszerek esetében ez a visszanyerési szint nem mindig lehetséges, különösen, ha bizonyos nehéz mátrixokat elemeznek. Ezen túlmenően a felmerült mintákból származó visszanyerés jelentősen eltérhet a spiccelt mintákból kapott értékektől.

"Emiatt az 50 és 150% közötti visszanyerés elfogadhatónak tekinthető mindaddig, amíg bizonyíthatóan konzisztensek."

Az iránymutatást 2010-ben tette közzé az Analitikai Közösségek Szövetsége (AOAC), különös tekintettel a kvantitatív ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) módszerekre. A legfontosabb pontok közül sok a minőségi vagy félkvantitatív LFD (Lateral Flow Device) módszerekre is alkalmazható.

A "tudomány" a spiking mögött

Amikor olyan új élelmiszertípust kapunk vagy találkozunk vele, amelyet még nem vizsgáltunk, elvégezzük a spike recovery validálását, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy a tesztkészleteinkkel megfelelően működik. Az allergén három különböző - alacsony, közepes és magas - szintjén spike-olunk, hogy lefedjük a vizsgálat kimutatási tartományát.

Az alacsony allergén-tüske közel lesz az ELISA alsó mennyiségi határához, LLOQ, (ebben az esetben a legalacsonyabb, 0 ppm feletti kalibrátorérték) vagy a laterális áramlású eszköz kimutatási határához, LOD, közel. A közepes tüske az ELISA kalibrációs görbe közepén lesz, a magas tüske pedig a mennyiségi meghatározás felső határán, ULOQ (a legmagasabb ppm értékű kalibrátor) vagy annak közelében lesz. A mintát a készlethez mellékelt termékmellékletnek megfelelően extraháljuk és vizsgáljuk.

Így például, ha 5 ppm mandulát teszünk csokoládéba, akkor 4 ppm és 6 ppm közötti visszanyerést várunk. Ha az eredmény ezen a tartományon kívül esik, akkor a visszanyerés javítására bizonyos lépésekkel lehet javítani. Tapasztalataink szerint a csokoládé az egyik legnagyobb kihívást jelentő élelmiszer-mátrix, amelyet vizsgálni kell - tele van tanninokkal és más polifenolokkal, amelyek kötődhetnek az esetlegesen jelen lévő allergén fehérjékhez, és oldhatatlan komplexeket képeznek, amelyeket nehéz kivonni.

Az ilyen nehézségek leküzdhetők az extrakciós pufferhez hozzáadott extra fehérje hozzáadásával. A felesleges fehérje megköti a polifenolokat, és az allergéneket hozzáférhetővé teszi az extrakcióhoz. Az általam választott fehérje a halzselatin, bár más anyag, például tejpor is használható a magas polifenoltartalmú élelmiszerekből történő extrakció hatékonyságának javítására. Ha tejport használ, ügyeljen arra, hogy ne szennyezze a laboratóriumi teret, különösen, ha tejallergén vizsgálatot végez.

A laterális áramlású eszközök, vagy csíkok vagy mártópálcák, ahogyan néha nevezik őket, az allergén ELISA tesztkészlethez hasonlóan validálhatók a tüskék visszanyerésére. A magas spike-szint kiválasztásakor azzal kell tisztában lenni, hogy bár az LFD-k képesek nagyon magas ppm-szintek kimutatására, túl sok allergén hozzáadásával túlterhelheti az eszközt. Ez az allergén élelmiszer 1%-nál nagyobb mennyiségben fordulhat elő.

A minőség és a vizsgálati pontosság fenntartása

Szükség lehet arra, hogy egy készletgyártó szorosan együttműködjön olyan ügyfelekkel, akik rutinszerűen tesztelnek kihívást jelentő élelmiszermátrixokat. Fontos ellenőrizni, hogy a készlet megfelelően és az ügyfél megelégedésére működik-e. Ez a fentiek szerint a problémás mátrixban végzett allergén-tüske helyreállítási kísérletekkel érhető el.

Bizonyos esetekben kívánatos lehet a standard készlet módszerének módosítása vagy megváltoztatása a minta és/vagy a vevő igényeinek megfelelően; ezt mindig a készlet gyártójának útmutatásával kell elvégezni a tesztkészlet minőségének és reprodukálhatóságának biztosítása érdekében.