Voltar para a Biblioteca Romer
Hogyan fejlesszünk ki egy LC-MS/MS-alapú, több mikotoxinra épülő módszert?
Gyakran előfordul, hogy a gabonafélék és a nyersanyagok egynél több mikotoxinnal szennyezettek. A Romer Labs olyan egyetlen módszert fejleszt, amely egyszerre több mikotoxint is képes kimutatni. Irene Hahn ismerteti, hogyan.
Körülbelül 400 alacsony molekulatömegű vegyületet ismerünk el mikotoxinokként, amelyek mindegyike különböző mérgező hatással van az emberekre és az állatokra. A lehetséges szennyező anyagok nagy száma, valamint a mikotoxinok együttes előfordulásának ismételt jelentései szükségessé teszik megfelelő kimutatási módszerek, például folyadékkromatográfia-tömegspektrometria (LC-MS/MS) alapú, több mikotoxinra épülő módszerek kifejlesztését, amelyekkel egyszerre több mikotoxin elemezhető. Az ilyen módszerek kifejlesztése kihívást jelent, mivel több, különböző kémiai tulajdonságokkal rendelkező toxin egy elemzésbe történő bevonása azt jelenti, hogy kompromisszumokat kell kötni az optimális módszerparaméterek kiválasztásakor.
Publicado em:
Mikotoxin
A mikotoxinok LC-MS/MS alapú elemzése
A fordított fázisú LC-MS/MS (LC-MS/MS) alapú analitikai módszerek az elmúlt évtizedben a mikotoxinok minőségi és mennyiségi analízisének hatékony és korszerű technikájává váltak. E módszer előnyei a nagy érzékenység és szelektivitás, a több mikotoxin elemzésére való alkalmazás, valamint a vizsgált analitok tömeg-töltés arányára (m/z) és fragmentumionjaira vonatkozó további információk szolgáltatása. Jelenleg erős tendencia mutatkozik a több mikotoxint tartalmazó módszerek LC-MS/MS alkalmazásával történő alkalmazása felé. Ezzel a technikával a különböző kémiai családokhoz tartozó mikotoxinok széles körének egyidejű meghatározása érhető el egyetlen mérésen belül. Azonban olyan kérdések, mint maguknak a vegyületeknek a kémiai sokfélesége, a vizsgált mezőgazdasági termékek széles skálája, a különböző koncentrációtartományok és az eltérő előfordulási eloszlások mind kihívást jelentenek a módszerfejlesztés és -optimalizálás szempontjából. Ezért kompromisszumokat kell kötni az extrakciós oldószer és a mobilfázis kiválasztásakor, és a körülmények messze nem lehetnek optimálisak bizonyos analitok esetében, amelyek között savas (fumonizinek), bázikus (anyarozs-alkaloidok), valamint poláris (moniliformin, nivalenol) és apoláris vegyületek (zearalenon, beauvericin) is előfordulhatnak. Ezen túlmenően a kereskedelemben kapható megfelelő analitikai standardok hiánya bizonyos analitokra vonatkozóan csak minőségi szűrési megállapításokat eredményez, nem pedig mennyiségi eredményeket.
Egy több mikotoxint tartalmazó LC-MS/MS módszer kifejlesztése
A gabonafélékben és gabonaalapú termékekben található mikotoxinok mennyiségi meghatározására szolgáló módszerek általában a reprezentatív mintavételből, az optimalizált mintaelőkészítési eljárásból és a tisztítási lépésből, valamint az elválasztást és kimutatást is magában foglaló analitikai technikából állnak.Az LC-MS/MS-en alapuló multimikotoxin-módszer felállítása általában négyfázisú folyamatot követ. Ezeket és a figyelembe vett paramétereket az 1. ábra foglalja össze. A módszerfejlesztés és optimalizálás során a paraméterek jelentősen befolyásolják az eredmények minőségét és megbízhatóságát, ezért gondosan értékelni kell őket. Ehhez az egyes vegyületek megadott tisztaságú analitikai standardjait kell használni. Bizonyos analitok esetében azonban a kereskedelemben nem állnak rendelkezésre analitikai standardok. Ezekben az esetekben lehetséges lehet olyan standardokhoz hozzáférni, amelyek még kutatás alatt állnak, vagy olyan rendelkezésre álló anyaggal dolgozni, amely kevésbé jól jellemzett.
Módszerfejlesztés
Az LC-MS/MS alapú módszer fejlesztése során ki kell dolgozni az MS és LC paramétereket, valamint a mintaelőkészítési eljárást. Az MS paraméterek optimalizálásához minden egyes vegyületet tiszta analitikai standardként közvetlenül a tömegspektrométerbe kell injektálni. Ezt követően ki kell értékelni az idealizálási módot (pozitív vagy negatív), a legnagyobb mennyiségben előforduló prekurzor- és termékionokat, valamint az ideális deklasszifikációs potenciálokat, ütközési energiákat és ütközési cellából való kilépési potenciálokat. Az LC paraméterek optimalizálása során ki kell értékelni az ideális mobilfázisokat és gradienst, valamint az optimális kromatográfiás oszlopot. Több mikotoxin elemzése esetén a mintaelőkészítési eljáráshoz a választott módszer a minta tisztítása nélküli hígítás és lövés, hogy a mintaelőkészítés során a mikotoxinmintát ne hamisítsuk meg. Például ritkán áll rendelkezésre olyan tisztítás (pl. szilárd fázisú extrakció), amely nem nyomja el a szükséges analitok egyikét sem. Mindazonáltal, ha nem alkalmaznak tisztítást, a mátrixban lévő, együttesen eluáló és zavaró komponensek befolyásolhatják a célanalitok ionizációs hatékonyságát, ami rosszabb ismételhetőséget és alacsonyabb pontosságot eredményezhet. Ezért az ilyen mátrixhatások meghatározása és kompenzálása alapvető fontosságú. Ez a látszólagos visszanyerés meghatározásával, majd az eredményeknek ezzel az értékkel történő korrekciójával, mátrixhoz igazított kalibrációval vagy izotópjelzett belső standardok használatával érhető el. Ez utóbbi a legnagyobb pontosságú és megbízhatóságú eredményekhez vezet, ugyanakkor minimális idő- és költségráfordítással.
A módszer optimalizálása
Az analitikai módszer optimalizálása magában foglalja az analitok stabilitásának vizsgálatát standard oldatban és mintákban, valamint a szelektivitás bizonyítását és a munkatartomány meghatározását.
A módszer validálása
A módszer validálása az összehasonlíthatóság és a nyomon követhetőség szempontjából megbízható eredmények előállításának előfeltétele. A módszer validálását minden egyes célanalitra külön-külön kell elvégezni az összes szükséges mátrixban. A mennyiségi módszer validálása során értékelendő tipikus teljesítményjellemzők a következők: kimutatási határérték (LOD), mennyiségi határérték (LOQ), linearitás, precizitás, szelektivitás, robusztusság, pontosság, mátrixhatás és visszanyerés. A módszer validálása úgy végezhető el, hogy a vakmintákat az egyes szükséges analitekkel egy koncentrációtartományban, ismétlésben spicceljük. Ha rendelkezésre áll, a módszer helyességét hitelesített referenciaanyagokkal kell megerősíteni. Ezen túlmenően a mátrixra illesztett anyagok és a jártassági vizsgálatokban való részvétel további minőségbiztosítást tesz lehetővé. Többek között a referenciaanyagok korlátozott száma felelős az ilyen szűrési módszerek félkvantitatív jellegéért. Bár a rutinelemzésben már alkalmazzák a multitoxin módszereket, figyelembe kell venni a magas beruházási és fenntartási költségeket.
A módszer végrehajtása
A bevezetés során a validált módszerrel valós mintákat, valamint minőségellenőrzési mintákat kell mérni. Ezenkívül a validált módszert rutinlaboratóriumokban kell bevezetni és használni, ami a laboratóriumi személyzet és a műszerek rendelkezésre állása szempontjából nehézségekbe ütközhet.
A mikotoxinok meghatározásának általános kihívásai
A mikotoxin-szennyeződések általában heterogén módon oszlanak el a mezőgazdasági terményekben, és "forró pontokon" koncentrálódhatnak. Ezért a mintavétel fontos és döntő lépés, mivel a reprezentatív minta elengedhetetlen a mikotoxinszintek pontos és precíz meghatározásához. A legtöbb analitikai technikával a mikotoxinok közvetlen kimutatása őrölt gabonamintákban nem lehetséges, ezért mintaelőkészítési eljárásokra van szükség.
Egy másik fontos lépés a minta extrakciója. A hagyományos szilárd-folyadék extrakció során a mikotoxinokat mechanikus rázással, különböző oldószer-keverékekkel (vizes és szerves), néha savas vagy lúgos módosítókkal extrahálják az őrölt gabonamintákból. Az így kapott kivonatok ezután tovább használhatók elemzésre. A szabályozási és tudományos célokra kifejlesztett analitikai módszerek többsége kromatográfiás elválasztáson, főként folyadékkromatográfián (LC) alapul, különféle detektorokkal kombinálva. A kromatográfiás oszlopról eluálódó analitok folyamatos nyomon követésére és kimutatására szolgáló LC-detektorok az UV/Vis-abszorbancia, a fluoreszcencia és a tömegspektrometria (MS) mérésén alapulnak. A mikotoxinok eltérő kémiai és fiziko-kémiai tulajdonságai miatt az ilyen analitikai módszerek többségét egy célvegyületre, vagy legjobb esetben egy szorosan rokon mikotoxincsoportra optimalizálták. Ezenkívül ezek a célzott módszerek gyakran tartalmaznak extrakciós és tisztítási lépéseket a nem kívánt mátrixkomponensek csökkentése vagy eltávolítása érdekében. Ennélfogva a keletkezett előfordulási becslés mindig az elemzett mintáktól, valamint az alkalmazott analitikai módszerekkel lefedett mikotoxinoktól függ.
Következtetés
Összefoglalva, az LC-MS/MS-en alapuló több mikotoxinra vonatkozó módszer kifejlesztése nagy kihívást jelent, ha megbízható és összehasonlítható mennyiségi adatok elérésére törekszünk. Az eredmények minőségét és megbízhatóságát jelentősen befolyásoló rengeteg különböző paramétert kell gondosan figyelembe venni minden egyes analit esetében, minden egyes mátrixban külön-külön. Ezenkívül a mikotoxinok kémiai sokfélesége azt jelenti, hogy a módszerfejlesztés során kompromisszumokat kell kötni, amelyek bizonyos analitok esetében messze nem lehetnek optimálisak. Ezen túlmenően a mezőgazdasági termékek széles skálája, valamint a különböző koncentrációtartományok és az eltérő előfordulási eloszlások további kihívást jelentenek a módszerfejlesztés és -optimalizálás szempontjából. Mindazonáltal a multimikotoxin módszerek fejlesztésére mindenképpen szükség van, és e technológia fejlődése tovább fogja bővíteni az alkalmazását.