Nem a szokásos gyanúsítottak: 5 hiányosság az Ön környezetvédelmi monitoring programjában

Még a legjobban megtervezett tisztítási és fertőtlenítési felügyeleti programoknak is vannak vakfoltjai. Stefan Widmann közelebbről megvizsgálja a környezeti felügyeleti program öt legvalószínűbb - és legveszélyesebb - hiányosságát, és elmagyarázza, hogy mik ezek, miért kell törődnie velük, és mit tehet ellenük.

#1 Életképes, de nem tenyészthető (VBNC) mikroorganizmusok

A mikrobiológusok sokáig azt feltételezték, hogy minden olyan baktérium, amely nem növekszik a normál táptalajon, halott. Az ezt követő kutatások feltárták, hogy a tenyészthető és a halott állapotokon túl létezik egy harmadik állapot is: az életképes, de nem tenyészthető (VBNC).

Általában a VBNC állapotban lévő baktériumok nem szaporodnak, de még mindig élnek, amint azt anyagcsere-aktivitásuk mutatja. Számunkra a legfontosabb, hogy az újraélesztés után kulturálhatóvá válhatnak, és így elszaporodhatnak az élelmiszerekben. Sőt, egyes patogén baktériumok gazdatest hiányában nem szaporodnak, és csak arra van szükségük, hogy az élelmiszerben a lenyelésig életben maradjanak ahhoz, hogy betegséget okozzanak.

Számos oka van annak, hogy a baktériumok VBNC állapotba kerülhetnek; az éhezés, a növekedéshez optimális hőmérsékleti tartományon kívüli inkubáció, a megemelkedett ozmotikus koncentráció, az oxigénkoncentráció szintje vagy a fehér fénynek való kitettség csak néhány ok. Az adott baktériumtörzs sajátos tulajdonságai határozzák meg, hogy pontosan mi okozza azt, hogy a baktériumok ebbe az állapotba lépjenek.

Miért kellene törődnie ezzel? Néhány, a VBNC állapotba belépni képes baktérium aggodalomra ad okot az élelmiszer-előállítás szempontjából. Bár még nem ismerjük az összes baktériumfajt, amely képes VBNC állapotba kerülni, ismerünk néhányat, amelyik igen; ezek közé tartoznak az indikátor szervezetek (például a Klebsiella aerogenes és a Klebsiella pneumoniae), a hamisítók (például a Lactobacillus plantarumés a Lactococcus lactis) és a kórokozók (például a Salmonella Typhimurium, a Campylobacter coli vagy a Listeria monocytogenes)is.

Miután azonosítottuk őket, most azt a kérdést kell feltennünk, hogy ezek a baktériumok visszatérhetnek-e teljes mértékben tenyészthető és potenciálisan patogén állapotba. A mikrobiológusok sokáig sötétben tapogatóztak ebben a kérdésben, mivel a VBNC-baktériumokat nehéz teljesen elkülöníteni a kulturálható baktériumoktól. A kutatók ezt a problémát részben statisztikai megközelítéssel oldották meg: a VBNC-baktériumok nagy számát olyan mértékben hígítják, hogy szinte lehetetlen, hogy kulturálható baktériumok maradjanak. A baktériumokat ezután egy meghatározott idő elteltével megszámolják. Ha nagyfokú növekedést figyelnek meg, az egyetlen lehetséges következtetés az, hogy a baktériumok elhagyták a VBNC állapotot, és tenyészthetővé váltak.

További következmény, hogy ha vissza tudnak térni a tenyészthető állapotba, akkor újra patogénné is válhatnak. Van példa arra, hogy pontosan ez a jelenség vezetett járványokhoz. Például a VBNC E. coli O157-et gyanították egy 1997-es japán járvány kitörésében, mivel az E. coli összlétszáma jelentéktelen volt, és az olyan shigatoxigén törzsek, mint az O157, nagyon alacsony számban okozhatnak megbetegedést.

#2 Anaerob és mikroaerofil baktériumok

Az anaerob baktériumok vagy általánosabban az anaerob mikroorganizmusok három csoportra oszthatók: obligát, aero-toleráns és fakultatív. Ahogy nevük is jelzi, mindegyiküknek különleges igényei vannak az őket körülvevő levegővel, pontosabban az oxigénnel szemben. Az obligát anaerobokat, mint például a Clostridioides difficile, károsítja az oxigén, és röviddel az expozíció után elpusztulnak. Az olyan légtűrő baktériumok, mint a Clostridium botulinum, nem képesek az oxigénre, és nem pusztulnak el, illetve nem növekednek annak jelenlétében. A fakultatív anaerobok képesek az oxigént felhasználni, de nincs szükségük rá a növekedéshez, mint például az E. coli esetében. Létezik a mikroaerofil baktériumok csoportja is, mint például a Campylobacter, amelyeknek szükségük van némi oxigénre a növekedéshez, bár sokkal kisebb mennyiségben (1-2%), mint a normál levegőben, de aerob körülmények között gátolhatók.

Miért érdekli ez Önt? Számos patogén baktériumnak vannak ilyen különleges növekedési igényei. Jelenleg a termotoleráns Campylobacter fajok okoznak aggodalmat a közegészségügyi szakemberek körében. Átlagosan minden második csirke Campylobacterrel fertőzött, így a baromfihús az egyik leggyakoribb ételmérgezés okozója. Az EU-ban a Campylobacter fajok által okozott megbetegedések kétszer olyan gyakran fordulnak elő, mint a szalmonella által okozott megbetegedések. Az anaerob csoportból egy Clostridia faj, például a C. botulinum felelős a botulizmus néven ismert, gyakran konzervált (azaz oxigénszegény) élelmiszerekkel terjedő élelmiszer-betegségért, amelyekben a C. botulinum elszaporodik és az emberre mérgező botulinum vegyületet termel. Egy másik Clostridia-faj, a C. perfringens, az USA-ban és Kanadában a leggyakoribb ételmérgezés forrása, és olyan tüneteket okoz, mint a hasi görcsök és hasmenés. A C. perfringens fertőzés kockázata különösen erősen korrelál a hosszabb ideig meleg körülmények között tartott vagy tárolt élelmiszerekkel, ami kedvez a fertőző számuk növekedésének (104 cfu/g).

#3 A nagy tányérszámlálási anomália

Egyes becslések szerint a baktériumoknak mindössze 1%-a tenyészthető a jelenleg rendelkezésünkre álló ismeretekkel és technikákkal. A "nagy lemezszám-anomália" kifejezéssel azt a megfigyelést jellemezzük, hogy a mikroszkópos sejtszám jelentősen magasabb, mint a megfelelő "kolóniaképző egységek" száma az agarlemezeken. Ezt a jelenséget néhány példa szemlélteti a legjobban: míg a szájflóra mikroorganizmusainak 50%-a tenyészthető agarlemezekkel, addig a gyomor-bélflóra nagy része egyáltalán nem tenyészthető. Ennek számos oka lehet, de fontos szerepet játszhat az adott fajt körülvevő élőlényközösség, beleértve más baktériumokat, valamint növényeket és állatokat is.

Az aerob lemezszámlálási módszerek nagyon általános táptalajokra támaszkodnak, amelyek a legtöbb baktériumcsoport növekedését nem támogatják. Technikailag ez nem igazán tartozik a nagy lemezszámlálási anomáliához, mivel egyes baktériumok speciális agarlemezeken, speciális körülmények között (például anaerob vagy mikroaerofil körülmények között) képesek növekedni.

Miért érdekli ez Önt? A nagy lemezszám-anomália nem okoz jelentős problémát a mindennapi vizsgálati folyamatok során, mivel az indikátor mikroorganizmusok aerob lemezszámának meghatározása az adott termelési környezetre jellemző, és mint ilyen, mindig az adott termelési környezetre meghatározott alapvonalhoz viszonyítva történik. A lemezes módszerek azonban nagyon időigényesek, mivel a hatályos protokolltól függően akár három nap inkubációs időt is igényelnek. Léteznek közvetlen módszerek, amelyek nem igényelnek tenyésztési lépést a baktériumok számolásához; a mikroszkópok átfogó képet nyújtanak a baktériumokról, de szintén nagyon időigényesek. Míg az olyan közvetlen módszerek, mint az áramlási citometria, elterjedtek a vízkezelő létesítményekben, az élelmiszeriparban nem gyakoriak.

#4 Pszichrotróf baktériumok

A pszichrotróf baktériumok akár 0 °C-os hőmérsékleten is képesek növekedni, optimális és maximális növekedési hőmérsékletük 15 °C felett van. Ez különösen problémássá teszi ezeket a mikrobákat az olyan élelmiszerek és italok esetében, mint a hosszabb ideig alacsony hőmérsékleten tárolt nyers hús és tej. Az élelmiszerekben leggyakrabban előforduló pszichrotróf baktériumcsoportok a Gram-negatív Pseudomonas, Aeromonas, Achromobacter, Serratia, Alcaligenes, Chromobacterium és Flavobacterium nemzetségek, valamint a Gram-pozitív nemzetségek, mint a Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptococcus, Lactobacillus és Microbacteria. A Listeria monocytogenes és a Clostridium botulinum egyes törzsei szintén képesek elszaporodni a hűtési hőmérsékleten.

Miért kell törődnie vele? A pszichrotróf baktériumok hamisítók, és jelentősen ronthatják az élelmiszerek minőségét és eltarthatóságát. A hűtött termelési létesítmények és tárolótartályok kedvező környezetet biztosítanak e baktériumfajok elszaporodásához. A hűtött tejben például a Pseudomonas fluorescens proteázokat és lipázokat is termelhet. Ezért a Pseudomonas nemzetségbe tartozó fajokat tipikusan felelősnek tekintik a technológiai nehézségekért, mivel az általuk termelt proteázok és lipázok a tejzsír és a fehérjék lebomlását okozhatják, ami a tej szürkés színét és keserű ízét eredményezi. A Pseudomonas fajok a leggyakrabban az aerob módon tárolt hűtött húsok romlásáért felelős mikroorganizmusok. Jól ismert, hogy a Pseudomonas fajok nagyon robusztusak és képesek ellenállni a stresszes környezeti feltételeknek, amelyek gátolják más romlást okozó mikroorganizmusok növekedését. A vákuumcsomagolt, hűtött nyers húsban a mikroflórát a legtöbb esetben pszichrotróf tejsavbaktériumok uralják. A kórokozók növekedése a hűtve tárolás során súlyos megbetegedésekhez vezethet.

#5 Biofilmek

A mikroorganizmusok úgy képesek kolonizálni a felületeket, hogy polimer mátrixot képeznek, amelyben több mikrobafaj is jelen lehet; ezt biofilmnek nevezzük. Bizonyított, hogy a biofilmek kialakításának és túlélésének képessége nem korlátozódik a mikroorganizmusok meghatározott csoportjaira. Valójában a baktériumok túlnyomó többsége képes biofilmek kialakítására. A biofilmek tehát akár monokultúrákból, akár több különböző mikroorganizmusfajból állhatnak. Egyes kutatók szerint a vegyes biofilmek összetett szerkezete stabilabbá és a tisztító vegyszerekkel szemben ellenállóbbá teszi őket. A felülethez kötődő kezdeti populáció megváltoztathatja a felület tulajdonságait, lehetővé téve a későbbiek számára, hogy sejtek közötti társulás révén megtapadjanak; egyes esetekben egy második faj kötődése növelheti a biofilm-populáció stabilitását. Vizsgálatok például azt mutatják, hogy az L. monocytogenes nagyobb valószínűséggel tapad meg az acélhoz Pseudomonas jelenlétében.

Miért érdekli ez Önt? Az élelmiszer-feldolgozó berendezéseken és egyéb élelmiszerekkel érintkező felületeken kialakuló biofilmek tartós szennyeződési forrásként működnek, veszélyeztetve az élelmiszerek általános minőségét és biztonságát, és esetleg élelmiszer eredetű megbetegedésekhez, valamint gazdasági veszteségekhez vezethetnek. A romlást okozó mikroorganizmusok közismerten az élelmiszer-ellátási láncok veszteségeinek közel egyharmadáért felelősek, ezért a biofilmek megelőzése és ellenőrzése kiemelt fontosságú az élelmiszeriparban. A biofilmekben kialakuló vagy elszaporodó mikroorganizmusok ellenállóbbak a fertőtlenítéssel szemben, ami az élelmiszeripar számos területén problémássá teszi őket. A biofilmek egyéb hatásai, mint például a fémfelületek korróziója, további kritikus problémát jelentenek az élelmiszeriparban. A biofilmek jelenléte az élelmiszeripari üzemekben mindkét esetben veszélyezteti az emberi egészséget. A kockázat mértéke attól függ, hogy milyen baktériumfajok alkotják ezt a háromdimenziós, élő struktúrát.

Hogyan zárja be ezeket a réseket? Az áramlási citometriában rejlő lehetőségek Az élelmiszergyártóknak általában nem sok lehetőség áll a rendelkezésükre. Azok, amelyek egy csekély pontosságot kínálnak, mint például a mikroszkópokkal kombinált vitális festés, képesek a VBNC-baktériumok számszerűsítésére, de időigényesek és speciális felszerelést igényelnek. Az anaerob és mikroaerofil baktériumok minden csoportja - a fakultatív anaerobok jelentős kivételével - képes növekedni a klasszikus agarlemezeken, de csak gondosan ellenőrzött oxigénszint mellett.

Az agarlemezek mégsem jelentenek csodaszert. Az agarlemezek az ismert baktériumfajoknak csak körülbelül 1%-át képesek megszámlálni, és napokba telik, amíg eredményt adnak - a pszichrotróf baktériumok esetében akár 10 napba is beletelhet. Az ATP-módszerek, bár gyorsak, nem számszerűsítik a baktériumokat, és csak korlátozottan alkalmasak a biofilmekből származó baktériumok kimutatására; a szabadon szuszpendált planktonikus sejtek kinetikai adatai nem használhatók referenciaként, mivel a biofilmek esetében az ATP felszabadulása sokkal alacsonyabb. Ráadásul az ételmaradékokból vagy gombákból származó ATP-nyomok könnyen háttérbe szoríthatják a baktériumok által kibocsátott ATP-t, mivel az eukarióta sejtek 10 milliószor több ATP-t tartalmaznak, mint a prokarióta sejtek. Ennek megfelelően a biofilmek kimutatására használt ATP-eszközök általában sokkal magasabb kimutatási határral rendelkeznek, ami azt jelenti, hogy nem olyan érzékenyek, mint a szabadon úszó baktériumok kimutatásakor.

Az öt eset mindegyike megmutatta, hogy milyen nehéz lehet a baktériumok és a maradékanyagok kimutatása az élelmiszer-előállító felületeken; a legelterjedtebb kimutatási módszerek, például a lemezes és az ATP-vizsgálat hiányosságai éppoly makacsok, mint amennyire jól dokumentáltak.

Mit tehetnek az élelmiszergyártók, hogy pótolják a kulturális módszerek és az ATP-vizsgálat által hagyott hiányosságokat? A következő cikkben kollégám, Cristian Ilea az impedancia-áramlási citometriában és a CytoQuant® áramlási citométerben rejlő lehetőségeket tárgyalja, amely egy új megoldás, amely azonnal számszerűsíti a felületeken lévő baktériumokat és maradék részecskéket.