Hamis-pozitív eredmények megelőzése a kórokozó-vizsgálatok során

A kórokozók kimutatásában a hamis pozitív eredmények költséges és fáradságos nyomon követése minimálisra csökkenthető a fágokkal, amelyek csökkentik a keresztreagáló baktériumok előfordulását a kórokozótesztekben. A keresztreagáló baktériumok hamis pozitív eredményeket okozhatnak, és gátolhatják a kérdéses kórokozó növekedését.

A téves pozitív eredmények az eredmények megerősítéséhez szükséges többletidőn kívül többletköltséget is okoznak az élelmiszer-előállítóknak. Az ISO/FDA/USDA szabványok szerint a vizsgálati eredmények megerősítésének folyamata a feltételezett pozitív mintából szelektív agarlemezek csíkozásával kezdődik. Ezeket az agarlemezeket két napig kell inkubálni annak bizonyítására, hogy valóban pozitív eredményű mintáról van-e szó, és a rutinmintáktól eltérő hőmérsékleten kell inkubálni. Ha a laboratórium nem rendelkezik további inkubátorral, akkor a fő inkubátort félre kell állítani és a szükséges hőmérsékletre kell beállítani, ami állásidőt jelent, mivel az inkubátor nem használható a dúsításhoz. A megerősítési lépés másik hátránya, hogy a szelektív agarlemezek pénzbe kerülnek. Mivel ezek eltarthatósági ideje nagyon korlátozott, nehéz raktáron tartani őket. Összességében a hamis pozitív tesztek felesleges időt és pénzt igényelnek.

A hamis pozitív eredmény problémája

Hamis pozitív eredmények minden kórokozó-kimutatási módszerrel előfordulhatnak. Nem számít, hogy DNS, biokémiai vagy immunológiai alapú technológiáról van szó. Mindegyik ugyanazt a problémát kezeli, a nagyobb érzékenységet a nagyobb szelektivitással szemben. Jó megközelítés a keresztreagáló baktériumok kimutatás előtti eliminálása, és erre a célra antibiotikumokat használnak. A legtöbb alkalmazáshoz azonban az antibiotikumoknak nincs szelektivitásuk.

A szelektivitás kihívásának leküzdése

A bakteriofágok (vagy fágok) a környezetünkben leggyakrabban előforduló szervezetek, amelyek nagy számban vannak jelen a vízben, az élelmiszerekben és számos más forrásban. Félix Hubert d'Hérelle kanadai biológus fedezte fel őket 1917-ben. Nevük azt jelenti, hogy "baktériumevők", ami némileg meghatározza, hogy mit is csinálnak. A bakteriofágok nagy gazdaspecifitással rendelkeznek, baktériumokhoz kötődnek. A fágok használatának nagy előnye, hogy ártalmatlanok az emberekre, állatokra és növényekre. Valójában az emberek rutinszerűen ki vannak téve a fágoknak az élelmiszer- vagy vízfogyasztáson keresztül, negatív hatások nélkül. A fágokat nevezhetjük a baktériumok "természetes ellenségeinek", amelyekre specifikusak. A feldolgozott húsban és húskészítményekben grammonként körülbelül 108 fág található. Az emberi gyomor-bélrendszerben is nagyszámú fág van jelen. Mielőtt az antibiotikumok széles körben elérhetővé váltak volna, a fágokat a bakteriális fertőzések kezelésére használták.

Évtizedekig használták

Az úgynevezett fágterápiát az USA-ban és a volt Szovjetunióban fejlesztették ki. Még akkor is, amikor a nyugati világban az antibiotikumokat fejlesztették ki, a volt szovjet blokk folytatta a fágterápia kutatását. A hidegháború utáni korszakban a fágokkal kapcsolatos kutatási tevékenységet Grúziában folytatták, ahol a mai napig folytatják. A fágok nagyon nagy specificitással rendelkeznek gazdabaktériumukkal szemben, ami olyan tulajdonság, amely potenciálisan érdekes alkalmazásokat jelent az élelmiszer- és takarmányiparban, valamint a biotechnológiai iparban. Ma a fágokat adalékanyagként használják az élelmiszerekben lévő patogén organizmusok eltávolítására, baktériumok kimutatására szolgáló eszközként, vagy a Romer Labs SELECT™ táptalajrendszerének kiegészítéseként a kompetitív baktériumflóra csökkentésére vagy akár megszüntetésére, lehetővé téve a célzott patogén baktériumfajok kimutatható mértékű növekedését. Szelektívebbek, mint az antibiotikumok, és a mikrobák nem fejlesztenek velük szemben rezisztenciát.

Keresztreaktív baktériumok azonosítása

A kompetitív baktériumok gátlására vagy akár elpusztítására szelektív dúsító közegekben vagy más alkalmazásokban felhasználható fágok azonosításához a kulcskérdés: hogyan lehet egyáltalán elkezdeni megtalálni őket? A legjobb módszer az élelmiszer- vagy takarmányminták vizsgálatával kezdeni, mivel ezek a vizsgálati anyagok olyan baktériumokat tartalmaznak, amelyeket a dúsítás során gátolni kell. Az olyan baktériumtörzsek, amelyek távolabbi rokonságban állnak, a keresett kórokozóval, nem célpontjai a fágoknak, de a célkórokozóval szoros rokonságban álló törzsek hamis pozitív eredményeket okozhatnak.

Transzgenikus? Egyáltalán nem!

A keresztreagáló háttérbaktériumok azonosítása után a következő lépés az ellenük ható fág keresése. A fágok mindenhol megtalálhatók, például a nyers szennyvízben, a felszíni vizekben, az élelmiszerekben és a mezőgazdasági környezetben. Kivonásuk legegyszerűbb módja, ha eladott mátrixról van szó, a centrifugálás. Ily módon a fágok a felülúszóban maradnak, míg a többi összetevő, például a baktériumok pelletet képeznek a tartály alján. Ez a felülúszó különböző fágok heterogén keverékét tartalmazza. Ezután a különböző fágokat izoláljuk, és meg kell határozni az általuk megfertőzött bakteriális gazdaszervezetet. Ezt megtehetjük az úgynevezett "puha agar túlságosan" technikával vagy egyszerű foltozással. Ennél a technikánál egy hagyományos agarlemezre baktériumokból álló gyepet helyeznek, és a fágszupernatánsokat a baktériumgyepre foltozzák. Egy éjszakai inkubáció után a fágok plakkokat (vagy tisztulási zónákat) hoznak létre, amelyek szabad szemmel is láthatóak. A plakkok olyan zónák, ahol a fágok lítikus reakcióval elpusztították a baktériumokat. Most már a fágklónok izolálhatók az agarról, ami azt jelenti, hogy mindannyian ugyanannak a fágtörzsnek a másolatai.

Hogyan segítenek a fágok

Most itt az ideje, hogy megtaláljuk a legjobb fágokat a patogén dúsításokban keresztreagáló baktériumok elpusztítására. Ezt úgy érjük el, hogy a fágokat a keresztreagáló baktériumokkal és a célkórokozóval szemben is teszteljük. A költségek minimalizálása és a tesztek felgyorsítása érdekében a mikrotiteres formátumot részesítjük előnyben. A lyukban látható lítikus reakció azt jelzi, hogy a fág hatásos a baktériummal szemben. Több laboratóriumi kísérlet után végül azonosítani lehet a megfelelő fágokat - ezek olyan fágok, amelyek gátolják a közeli rokon baktériumtörzsek növekedését, ugyanakkor nem befolyásolják a célkórokozó növekedését. Ezek a fágok ezután a kórokozók kimutatására szolgáló tesztrendszerekben a keresztreagáló baktériumok kiküszöbölésére használhatók, csökkentve a hamis pozitív jelzések előfordulását a kórokozó-ellenőrzési programban, és ezáltal sok pénzt és időt takaríthatnak meg.