Gyors környezeti higiéniai vizsgálati technológiák: Közelebbről

Az általánosan használt környezeti vizsgálati technológiák két általános megközelítésre oszthatók: a szermaradványok és a mikroorganizmusok vizsgálata. A következőkben az egyes megközelítéseken belüli különböző technológiákat, azok működését, alkalmazhatóságát és előnyeit vizsgáljuk.

Szermaradványok vizsgálata

ATP-módszerek

Az adenozin-trifoszfát (ATP) egy nukleotid, amelyet a sejtek az energiaellátás koenzimjeként használnak. Úgy is felfogható, mint az összes élő sejtben az energia átadásának molekuláris "valutaegysége". Az energiára minden sejtszintű tevékenységhez szükség van, beleértve a fehérjék és a membránok szintézisét, a sejtmozgást és a sejtosztódást. Az energia átadása akkor történik, amikor az ATP adenozin-difoszfátra és adenozin-monofoszfátra bomlik. A foszfátok kovalens kötéseinek hidrolízise során energia szabadul fel, amelyet a reakciókhoz használnak fel.

A kereskedelemben kapható ATP-tesztrendszerek a természetben igen gyakori luciferin/ luciferáz reakciót használják fel arra, hogy az ATP által biztosított energiával látható fényt hozzanak létre. Minél több fényt bocsát ki, annál több ATP van jelen, ami több élelmiszer-maradékot vagy több mikroorganizmust jelez. Van azonban egy fontos kikötés: mivel ezeket a rendszereket széles körben használják a tisztítási hatékonyság validálására, a reakcióban általában fertőtlenítőszerek is részt vesznek. Ezek a fertőtlenítőszerek megzavarhatják a mikroorganizmusok sejtfalát, de megőrzik ATP-jüket, ami azt jelenti, hogy nem biztos, hogy valós összefüggés van a felületen jelen lévő élő szervezetek és az ATP-mérés eredményei között.

Az ATP-módszerek további potenciális hátrányt rejtenek magukban: alkalmazhatóságuk a kimutatandó élelmiszer-maradéktól függően változik. Az ATP-vizsgálat például nem alkalmas a búzaliszt vizsgálatára, mivel ez egy erősen feldolgozott mátrix, amely kevés ATP-t hagy maga után a maradékban. A húskészítmények maradványai azonban nagy mennyiségű ATP-t tartalmaznak.

Az összes fehérje kimutatásának módszerei

Egy másik maradékanyag-vizsgálati megközelítésként az összfehérje-kimutatási módszerek nem magukat a mikroorganizmusokat, hanem inkább az aminosavakat, peptideket és fehérjéket vizsgálják. Ezek a tesztek nagyon gyorsak, és egy percen belül eredményt adnak. A kimutatás nem elég érzékeny az egysejtű mikroorganizmusokból származó fehérjék kimutatásához. Ezért az ilyen típusú tesztek negatív eredménye nem jelenti a mikroorganizmus hiányát. Ezenkívül ezzel a módszerrel nem lehet kimutatni specifikus kórokozókat. A fehérje kimutatására szolgáló tesztkészleteknek mégis megvan a maguk haszna, mivel gyors és megfizethető módon adhatnak jelzést a tisztítás hatékonyságáról.

Mikroorganizmus-vizsgálat

Kromogén tenyésztési módszerek

Ezek a hagyományos módszerek a feldolgozási környezet higiéniájának ellenőrzésére. A tenyésztési módszerekkel az ISO 18593 "Az élelmiszerlánc mikrobiológiája - Horizontális módszerek a felületi mintavételhez" című szabvány foglalkozik. Nem szelektív és szelektív táptalajok használhatók specifikus organizmusok kimutatására.

Kromogén agar alapú módszerek

Általában kétféleképpen lehet agar alapú módszereket végezni; vagy közvetlenül, vagy közvetve, hígítási lépéssel. Mindkettő előnye, hogy mennyiségi eredményeket adnak.

A közvetlen módszereknél a lemezek vagy merülőlemezek agarját közvetlenül a mintázandó felületre nyomják. A kontaktlemezek a klasszikus Petri-csészék formáját követik, és jellemzően 25 cm² felületűek. A dip-slides kétoldalas, műanyag csővel védett agarlapátok, amelyek agarfelülete a lapát mindkét oldalán 7-10 cm², azaz 14-20 cm². Ezek a rendszerek nem igényelnek további felszerelést, és a mintavételi eljárás nagyon gyors. Az ezzel a módszerrel történő mintavételezési terület azonban korlátozott.

A tamponok, szövetek és szivacsok a közvetett mintavétel eszközei. Miután a vizsgálandó felületre tamponnal letöröljük őket, pufferoldatban hígítjuk őket, amelyet aztán hagyományos Petri-csészékbe pipettázunk, és csíkozzuk ki. A vizsgált felület sokkal nagyobb lehet, és szűk terek és rések is vizsgálhatók indirekt módszerrel. Az indirekt módszereknek azonban van egy hátránya: több kezelési lépés és további kellékek szükségesek. A kórokozók kimutatásához az ISO-szabvány 1000 cm² és 3000 cm² közötti felületet javasol; ekkora területet csak szivacsokkal vagy tamponokkal lehet kezelni.

Kromogén folyékony táptalajon alapuló kimutatási módszerek

Ez a kulturális módszer csak bizonyos organizmusok vagy organizmuscsoportok kimutatására, de nem számolására szolgál, mivel nem szolgáltat mennyiségi eredményeket. A folyékony táptalajon alapuló módszereknél tamponokat használnak a mintavételhez, majd ezeket szelektív táptalajjal töltött csövekbe helyezik. Átlagosan legalább 48 órát vesz igénybe az inkubáció a feltételezhetően negatív eredményekhez. A pozitív minták azonosítása a feldúsított minta színváltozásával vagy fluoreszcenciájával történik egy adott hullámhosszon. Ezek a tesztek általában könnyen használhatóak és megfizethetőek.

A folyékony táptalajon alapuló rendszerek hátránya az alacsony érzékenységük, ami az erősen szelektív táptalajoknak köszönhető, amelyek szándékosan elnyomják más baktériumok növekedését. Ez bizonyos kockázatot rejt magában: a baktériumok a feldolgozási környezetben már stresszesek, és elpusztulhatnak, ha a dúsító közegek túlságosan szelektívek. Másrészt, ha a szelektivitás túl alacsony, nehéz lehet kimutatni a specifikus mikroorganizmusokat kizárólag szelektív folyékony táptalajok használatával. Az eredmények értelmezése nehézzé és szubjektívvé válhat, mivel a színváltozás vagy a fluoreszcencia nem mindig elég erős ahhoz, hogy végleges eredményt jelezzen. A folyékony táptalajon alapuló módszerek fő előnye, hogy könnyen kezelhetők és megfizethetők.

DNS-alapú módszerek

Három különböző DNS-alapú módszer létezik: a DNS izotermikus amplifikációja, a valós idejű és a hagyományos PCR. A valós idejű PCR a DNS vagy RNS kimutatásának bevált módszere, míg az izotermikus amplifikáció egy újszerűbb technológia. Az izotermikus amplifikáció használatának egyértelmű előnyei vannak a valós idejű PCR-rel szemben: például az izotermikus amplifikáció nem igényel termociklert, mivel a reakció állandó hőmérsékleten zajlik. A legköltséghatékonyabb, de egyben legmunkaigényesebb DNS-alapú módszer a hagyományos PCR, mivel az amplifikáció után hibridizációs lépést kell végezni, vagy egy meglehetősen nem specifikus festéket kell használni az amplifikáció után az amplifikált DNS vagy RNS kimutatásához. Minden módszer esetében a DNS vagy az RNS specifikus részeit specifikus primerek ismerik fel, majd az enzim polimeráz segítségével megsokszorozzák. E módszerek érzékenysége figyelemre méltóan magas, és a DNS vagy RNS célterületeit jól ismerik. A rendszer legnagyobb korlátja, hogy enzimalapú rendszerről van szó. Az enzimeknek meghatározott pufferoldatokra van szükségük a megfelelő működéshez. A fertőtlenítőszerek összetevői befolyásolhatják az enzimaktivitást, ami hamis negatív eredményekhez vezethet. A technológia emellett több mikrocsipettázási lépést is igényel, ami komoly hibaforrás lehet. A DNS-alapú módszerek legnagyobb előnye, hogy a módszer nagy érzékenységének köszönhetően a dúsítási lépéshez nem szelektív közegek is használhatók. A nem szelektív táptalajok megfizethetőek, különböző beszállítóktól kaphatók, és a legalacsonyabb biológiai biztonsági szintet (1. szint) igénylik. A DNS-alapú módszerekkel dúsítás nélkül is kimutathatóak kis mennyiségű kórokozók a környezeti felületeken, de az érzékenység alacsony a dúsításon alapuló módszerekhez képest. Végül pedig komoly problémát jelenthetnek a már elpusztított kórokozók DNS-töredékeiből származó hamis pozitív eredmények.

Immunológiai módszerek

Az immunpróbák olyan rendszerek, amelyek antitesteket használnak a mikroorganizmusok oldatokban való jelenlétének kimutatására. Ezek az antitestek antigénekhez, például az egyes mikroorganizmusok sejtfelszínén lévő lipopoliszacharidokhoz vagy flagellákhoz kötődhetnek. Egyszeri vagy többszöri, szelektív táptalajokat tartalmazó dúsítási eljárást követően a kórokozókat, például a Listeria sejteket specifikus antitest alapú tesztrendszerekkel lehet kimutatni. Az ELISA (enzimhez kötött immunszorbiens tesztek) voltak az első olyan tesztek, amelyek immunológiai technológiát alkalmaztak a specifikus mikroorganizmusok kimutatására. Az ELISA lehetővé teszi a kimutatott analit mennyiségi meghatározását, de a dúsítási lépés szükségessége kizárja a kezdeti koncentráció kiszámítását. Csak képzett személyzet képes elvégezni az ELISA-hoz szükséges többszörös átviteli és mosási lépéseket. A laterális áramlású eszközök, más néven csíktesztek kifejlesztése megoldotta ezt a problémát, így az immunológiai kimutatási eljárás sokkal egyszerűbbé és gyorsabbá vált, és megszüntette az ELISA-tesztek munkaterhelését. A szelektív antitestekkel ellátott LFD-k nagy teljesítményű dúsító közeggel kombinálva gyors és pontos eredményeket tesznek lehetővé anélkül, hogy drága berendezésekre vagy a képzéssel kapcsolatos költségekre lenne szükség.

Következtetés

A megfelelő higiéniai vizsgálati technológia kiválasztása nem mindig könnyű feladat. Számos gyakorlati szempont befolyásolja a döntést: hány mintavételi helyet kell vizsgálni, és mennyire fontos a tesztelési teljesítmény? Hogyan optimalizálhatják a tesztelők az eredményig eltelt időt, tekintve, hogy egyes patogén baktériumok vizsgálatát nem minden nap végzik, és az inkább felügyeleti feladat, mint minőségellenőrzési eljárás? Szükség van-e mennyiségi eredményekre, vagy elegendő a jelenlét/hiány vizsgálata? Mivel még mindig nem lehetséges a baktériumszámlálás közvetlenül a tisztítás után, a gyártók ATP- vagy fehérjealapú vizsgálati rendszerekre támaszkodhatnak, amelyek homályos jelzőként szolgálhatnak arra vonatkozóan, hogy biztonságosan megkezdhető-e a termelés, azaz van-e ATP vagy fehérje. A nemzeti előírások is befolyásolhatják ezt a döntést. A dúsításon alapuló DNS- vagy immunológiai módszerek érzékenység és szelektivitás tekintetében felülmúlják a többi módszert, és a kórokozók kimutatására a választott rendszereknek kell lenniük. Az indikátororganizmusok kimutatására és számlálására vagy az általános higiénia ellenőrzésére olcsóbb rendszerek, például dip-slides vagy ATP-rendszerek használhatók.