Voltar para a Biblioteca Romer
A kisebb jobb: A részecskeméret csökkentése révén javítja a mikotoxinelemzés eredményeit
A legújabb kutatások azt mutatják, hogy a minta részecskemérete jelentős hatással van a mikotoxin-analitikai módszerek pontosságára. Henriette Hobbs és Nora Kogelnik mikotoxinszakértők felmérik a problémát, és néhány ajánlást tesznek annak érdekében, hogy mikotoxinvizsgálati műveletei pontosak és megbízhatóak maradjanak.
Publicado em:
Mikotoxin
A mikotoxinok analitikai közösségében általában három fő eljárási lépéssel dolgozunk, amikor olyan mezőgazdasági termékekről van szó, mint a kukorica, a búza és az árpa: mintavétel, mintaelőkészítés és elemzés. Egy ömlesztett tételben lévő mikotoxin-koncentráció meghatározásához a tétel egy kisebb, de még mindig reprezentatív részét kell elemeznünk; ez azt jelenti, hogy megbízható eredmények nem érhetők el megfelelő mintavételi terv nélkül, amely magában foglalja a tételből történő többszöri mintavételt és ezek egyesítését egy részmintává (más néven ömlesztett mintává). Ez képezi azt az alapot, amely biztosítja, hogy a vizsgálandó minta valóban reprezentatív legyen a tételre nézve. Innentől kezdve a hangsúly a minta előkészítésére helyeződik. A gabonaalapú termékek esetében a minta előkészítése két fontos lépésből áll, a minta őrléséből és a részmintavételből: 1) a szemcseméret csökkentése és az egyenletesség biztosítása érdekében malom vagy más eszköz segítségével őröljük meg a szemcséket az ömlesztett mintában; 2) ebből a mintából az egész tételre reprezentatív részmintát nyerünk, amelyet ezután vizsgálunk. Ezt a vizsgálati mintát ezt követően egy meghatározott protokoll szerint előkészítjük az extrakcióhoz [10]. A mintavétel és a mintaelőkészítés azonban összetett folyamat, tele lehetséges buktatókkal; a mintaelőkészítési folyamat minden egyes lépése olyan szintű változékonyságot eredményez, amely hozzájárul az egyetlen analitikai eredmény teljes változékonyságához [2, 5]. Számos tanulmány kimutatta, hogy a megfigyelt variabilitás kétharmada a mintavétel módszeréből, egyharmada pedig a minta előkészítésének módjából adódik. A változékonyság sokkal kisebb hányada az alkalmazott analitikai módszerrel függ össze (1. ábra). Ennek megfelelően a pontos eredmények attól függnek, hogy milyen mértékben vesszük figyelembe ezt a három tényezőt. Míg számos tanulmány tárgyalja a mintavételi módszerek és az analitikai oldószerek jelentőségét a mikotoxinok kimutatásának hatásában (lásd [1, 2, 4] a kiemelkedő példákat), ez a cikk a minta előkészítésének, azaz a csiszolásnak és a minta méretének fontosságát vizsgálja, és a témával kapcsolatos legújabb kutatásokat összefoglalva tárgyalja a minta előkészítésének hatását a pontos mikotoxin analízisre és a minta szórására [10].
Válasszon ki egy reprezentatív mintát
Ha egy áru természetes módon mikotoxinnal szennyezett, a szennyezett magok általában egyenlőtlenül oszlanak el egy adott tételben; a szennyezett magok e csoportosulásait "forró pontoknak" nevezik. Ahhoz, hogy pontos képet kapjunk egy tétel szennyezettségi fokáról, a mintavételi tervnek figyelembe kell vennie az ilyen forró pontok véletlenszerű eloszlását. Ez úgy történik, hogy a reprezentatív minta elérése érdekében nagyszámú, kis méretű, fokozatos mintát vesznek a tétel különböző pontjairól, a tételben elosztva (2. ábra) [8]. Az ömlesztett tételből történő egyedi minták kiválasztása döntő fontosságú, hogy minden szemcse egyenlő eséllyel kerüljön kiválasztásra, ezáltal csökkentve a torzítást [10].
Az egységes szemcseméret biztosítása érdekében történő őrlés
A mikotoxinokat előállító penészgombáknak többféle fertőzési útvonala van; ennek következtében a mikotoxinok a szemek belsejében és a felszínen egyaránt megtalálhatók. A fertőzési útvonal a mikotoxintól és az adott gabonától függ. Jól ismert, hogy bizonyos mikotoxintermelő gombák, mint például a Fusarium, a gabonaszemen vagy a magon belül, míg mások, mint például az Aspergillus, a felszínen vannak jelen. A minta egyenletes őrlése megoldja ezt a problémát azáltal, hogy a szennyezett magokat feltöri, és lehetővé teszi a részecskék egyenletes eloszlását. Ez végső soron javítja a szennyezett részecskék kimutatását [3].
A lehetséges mikotoxineloszlás homogenizálása a gabonaszemek rostán való átvezetésével és keverésével.
A tételre reprezentatív minta kiválasztása és az egységes szemcseméret biztosítása érdekében történő őrlés után a mintát alapos keveréssel homogenizálni kell; ez is segít abban, hogy a minta reprezentatív legyen a nyers mintára nézve [3]. A szemcsék méret szerint szétválnak, ami csökkenti a minta reprezentativitásának mértékét, és pontatlan analitikai eredményhez vezet. Ezért a keverés előtt az őrölt mintát egy rácson vagy szitán átengedve meggyőződünk arról, hogy az őrlés egyenletessége megfelelő. A cél nem a nagyobb részecskék kiszűrése, mivel azok is tartalmazhatnak mikotoxinokat; éppen ellenkezőleg, ezeket a nagyobb részecskéket is be kell vonni a mintába. Inkább az őrlés egyenletességét biztosítjuk azáltal, hogy ellenőrizzük, hogy a részecskék bizonyos százaléka át tud-e menni. Az USDA-FGIS például az aflatoxin, a deoxinivalenol, a fumonizin, az ochratoxin és a zearalenon esetében a minta méretére, a minta őrlésére és a részmintavételre vonatkozó előírásokat állapított meg [9]. Az USDA-FGIS azt ajánlja, hogy a mintát úgy kell őrölni, hogy a részecskék 60-75%-a átmenjen a 20-as szitán, és hogy 50 g vizsgálati mintát (beleértve a szitán át nem eső részecskéket is) kell használni a mikotoxin extrakciójához.
A szemcseméret legyen kicsi, a minta mérete nagy, és a mikotoxin eredmények pontosak.
Ebben a cikkben végig a "pontosság" és a "precizitás" kifejezéseket használjuk, ezért itt egy gyors definíciót kell adni ezekre a fogalmakra: a pontosság és a precizitás az elemzéssel kapcsolatos bizonytalanságokat jelöli, amelyek a kezdeti mintaelőkészítési módszerből vagy tervből adódhatnak. A pontosságot úgy határozzuk meg, mint a mért értéknek a valódi értékhez való közelségét, míg a pontosságot a mért értékek egymáshoz való közelségeként definiáljuk. A végső cél egy olyan folyamat megvalósítása kell, hogy legyen, amely egyszerre biztosítja a nagy pontosságot és a nagy precizitást [10]. A vizsgálatok azt mutatják, hogy a mikotoxin kimutatási módszer pontossága és ezáltal az eredmények szórása nagymértékben függ a mintában lévő részecskék méretétől. A mintán belüli részecskék méretével és az elemzett minta méretével összefüggő mérési változékonyság bemutatására több, ezt értékelő tanulmányra hivatkozunk (3. ábra és 4. ábra). A Whitaker és munkatársai által végzett első vizsgálatban (a 3. ábrán látható) aflatoxinnal természetesen szennyezett kukoricamintákat jellemeztek. A különböző méretű szemekből álló mintákat ezt követően 20-as számú szitán áteresztették: 1) durva őrlésen (a szemcsék 60%-a ment át), 2) finom őrlésen (a szemcsék 99%-a ment át) és 3) porított (kalapácsos malommal). Ezután minden őrlési intervallumból nyolc mintát elemeztünk egy módosított HPLC-referenciamódszerrel, hogy kimutassuk a minták közötti eltérést egyetlen őrlési állapoton belül [9].
Amint az a 3. táblázatban látható, az analitikai eredmények a minta és az őrlés méretétől függően változnak. Hogyan tudjuk mégis számszerűsíteni ezt a szórást számunkra hasznos módon? A relatív szórást (RSD) vagy a variációs együtthatót (CV) gyakran használják annak meghatározására, hogy egy adott adatsorban mennyire eltérőek az eredmények. Az RSD-t gyakran százalékban adják meg, és a szórás és az átlag hányadosa határozza meg. Minél kisebb a szórás, annál kisebb a szórás az adathalmazon belül, és annál megbízhatóbb az eredmény. A 3. táblázatban bemutatott vizsgálat adataiban a különböző szemcseméretekből álló 10 g-os minták között jelentős eltérés volt megfigyelhető. A durván őrölt 10 g-os minták mutatják a legnagyobb, 40%-os RSD-t a finomabb őrlésű mintához (99%-os, 20 szemcsés minta) képest, amelynek számított RSD-je 7%. A legalacsonyabb, 4%-os RSD-t a kalapácsmalomból származó porított mintáknál érték el. Bár a kalapácsmalom jellemzően nem lehet anyagilag megvalósítható egy átlagos vizsgáló számára, Whitaker és munkatársai tanulmánya azt mutatja, hogy a minta előkészítéséből származó eltérések elkerülésének legjobb módja a finomra őrlés és a szemcseméret egyenletességét biztosító szemcseháló használata [9].
A szemcseméret (őrlés) és a minta méretének a különböző mikotoxinok közötti analitikai variabilitásra gyakorolt hatásának további bemutatására Brunkhorst és munkatársai teljes aflatoxinnal (B1, B2, G1 és G2 összege), teljes fumonizinnel (B1, B2 és B3 összege) vagy zearelenonnal természetes módon szennyezett kukoricamintákon végeztek elemzést (4. ábra). E vizsgálathoz minden mikotoxin esetében 10 kukoricamintát különböző szemcseméretűre őröltek, hogy azok átmenjenek egy sz. 10-es szitán, 20-as szitán vagy 20-as szitán. 30-as szitán. A különböző mintaméretek (1 g, 5 g, 10 g és 25 g) extrakcióhoz való eltérését is tovább vizsgálták. Az aflatoxinmintákat acetonitril/víz (84/16) extrakcióval extrahálták, majd AOAC-módszerrel és KOBRA cellával elemezték az oszlop utáni brómozáshoz. A fumonizin mintákat metanol/víz (3/1) extrakcióval extrahálták és szintén az AOAC módszere szerint elemezték. A zearealenon-mintákat szintén acetonitril/vízzel extraháltuk és LC-MS/MS segítségével elemeztük. Megjegyzés: Az egyes grafikonpárokban feltüntetett adatok némileg redundánsak. Hasznosnak tartjuk azonban a variációs együttható külön grafikonon történő ábrázolását. Az eredmények egyértelműen mutatják, hogy az őrlési méret és a minta nagysága befolyásolja az elemzés pontosságát. A tanulmány azt sugallja, hogy az AFLA és a ZON nagyobb fokú függést (azaz magasabb CV-t) mutat a minta mennyiségétől és az őrlési mérettől, mint a FUM, bár habozunk határozott következtetést levonni ezekből az egyes tanulmányokból; további kutatásokra van szükség megfigyelésünk megerősítéséhez. Az 1 g és 5 g-os mintaméretek esetében az AFLA, a FUM és a ZON esetében az RSD magasabb volt, mint a 10 g-os és 25 g-os mintaméretek esetében. Az AFLA-val szennyezett kukorica 10 g-os mintája esetében megfigyelt változékonyság 58,9%-ról (durván őrölt) 9,3%-ra (finoman őrölt), a FUM esetében 39,8%-ról (durván őrölt) 4,6%-ra (finoman őrölt), a ZON esetében pedig 21%-ról (durván őrölt) 2%-ra (finoman őrölt) csökkent. Ezek az eredmények tovább erősítik az őrlési méret hatását az analitikai szórásra és pontosságra a mikotoxinok szemekből történő kivonása és elemzése tekintetében.
Végül Brunkhorst és munkatársai tovább pontosították eredményeiket, és ugyanezzel a vizsgálati vázlattal deoxinivalenolszinteket határoztak meg természetes úton szennyezett árpamintákban. Az árpamintákat négy különböző szemcseméretre őrölték, extrahálták (10 egyedi kivonatot minden szemcseméret és mintaméret esetén) acetonitril/víz (84/16) használatával, és LC-MS-MS-sel elemezték (5. ábra) [6]. Az eredmények egyértelműen bizonyítják, hogy az analitikai variabilitás csökkenthető, ha a mintákat finomabb szemcseméretűre őröljük. Továbbá a minta méretének növelése tovább segít az analitikai variabilitás csökkentésében. A variációs együtthatót 11%-ról mindössze 5%-ra sikerült csökkenteni, amikor 10 g-os mintát használtunk, a nem. 10-es szemcsemérettel. A 10 g-os és 25 g-os mintaméret a 20-as szembőségű (95%) és a 20-as szembőségű (95%) és a 25 g-os szembőségű (95%) mintával kombinálva. 30-as szemű (95%) mintával kombinálva pontos és precíz eredményeket ad, és a CV-t 5%-ra, illetve 3%-ra csökkenti. Mivel ebben a vizsgálatban kukorica helyett árpát használtak, ez arra utal, hogy a mintaméret és az őrlés hatása a mikotoxinok analitikai változékonyságára nem feltétlenül mátrixfüggő. Ennek megerősítéséhez további vizsgálatokra van szükség [6].
Következtetés: Hálózás, keverés, szükség szerint ismétlés
A minta őrlésének és a minta méretének fontossága, valamint e tényezők hatása a variabilitás csökkentésére és a hibák minimalizálására a mikotoxinok elemzése során nyilvánvaló. A bemutatott vizsgálatokban jelentős eltérést figyeltek meg az azonos forrásból és szennyezettségi szintről származó durván és finoman őrölt minták között. A variáció egyszerű megfigyelésén túlmenően az e vizsgálatokból származó adatok a mintaméret és az őrlés néhány kezdeti megközelítését javasolják. A mintaméret tekintetében a 10 g elegendőnek bizonyult, míg a 25 g még nagyobb pontosságot biztosíthat. Ha 20-as szemű lyukasztót használunk, a minta 95%-ának át kell mennie rajta. Ha egy no. 30-as szembőségű hálót használva a minta 100%-ának kell átmennie. A mikotoxinelemzés fő célja, hogy pontos és megbízható eredményeket kapjunk a mintavétel nehézségei, valamint a gabona és a termények mintaelőkészítésének bonyolultsága ellenére. Ám még a legjobb technológia - legyen szó akár a legmodernebb gyorstesztekről, akár a nagy pontosságú tömegspektrometriás berendezésekről - semmit sem ér, ha a minta nem reprezentatív a vizsgált tételre nézve. A reprezentatív mintához több kell, mint a mintavétel; a minta előkészítése kulcsfontosságú. Ha betartja a mintaelőkészítés három kulcsfontosságú tényezőjét (őrlési méret, minta mérete és homogenitás), akkor az RSD-t <10%-on tarthatja, növelve ezzel az analitikai eredmény megbízhatóságát.