7 cose che deve assolutamente sapere sui materiali di riferimento per le micotossine

I materiali di riferimento qualificati sono un prerequisito per la qualificazione e la quantificazione di successo nella chimica analitica. Ma come vengono prodotti? Come può essere sicuro che soddisfino gli standard di qualità di cui ha bisogno il suo laboratorio? Cosa sono i materiali di riferimento certificati? Come si fa a dare un senso al certificato? Helmut Rost di Romer Labs risponde a queste domande comuni e ad altre ancora.

1. Perché abbiamo bisogno di materiali di riferimento?

La risposta breve è che gli enti regolatori e certificatori richiedono o raccomandano che i laboratori li utilizzino. Gli Stati Uniti e l'Unione Europea1, ad esempio, regolano entrambe diverse micotossine stabilendo i livelli massimi per questi contaminanti nei mangimi e negli alimenti. Inoltre, i laboratori accreditati secondo la norma ISO 17025 devono utilizzare materiali di riferimento qualificati e competenti per mantenere il loro accreditamento.

La risposta un po' più lunga è che i laboratori utilizzano materiali di riferimento per aumentare l'affidabilità dei loro risultati. Negli ultimi decenni, l'analisi di contaminanti come le micotossine è diventata sempre più importante per la caratterizzazione e la valutazione di campioni di alimenti e mangimi. I materiali di riferimento sono sostanze con caratteristiche definite, come l'aflatossina B1 disciolta in acetonitrile ad una concentrazione di 2 µg/mL. Le caratteristiche specifiche di un materiale di riferimento - e, cosa importante, la sua purezza relativa - forniscono un punto di riferimento con cui i tecnici di laboratorio possono confermare l'accuratezza dei propri risultati.

2. Come viene definito un materiale di riferimento?

Un materiale di riferimento è sufficientemente omogeneo e stabile rispetto alla sua proprietà specifica; ad esempio, ha una certa percentuale di purezza di una o più micotossine come solido o una certa concentrazione come standard liquido. Queste qualità ne garantiscono l'idoneità all'utilizzo nel processo di misurazione. I produttori di materiali di riferimento che soddisfano i requisiti della norma ISO 17034:2016 ("Requisiti generali per la competenza dei produttori di materiali di riferimento") sono considerati competenti. Il testo della norma ISO elenca i requisiti corrispondenti in diverse decine di pagine, insieme a ulteriore letteratura.

In sintesi, il materiale candidato deve essere ben caratterizzato in termini di identità e purezza prima di poter essere impiegato come starter di qualsiasi materiale di riferimento. Un piano di produzione assicura una documentazione corretta per tutti i lotti prodotti. I test di stabilità a lungo e breve termine a diverse temperature devono dimostrare che il materiale è stabile fino alla data di scadenza specificata. Un test di omogeneità per ogni lotto conferma che il materiale è distribuito in modo uniforme nei recipienti di spedizione. Tutte le analisi devono soddisfare i requisiti della norma ISO 17025; un accreditamento ISO 17034 significa che il laboratorio è accreditato secondo la norma ISO 17025 con i suoi metodi analitici.

3. Come vengono prodotti i materiali di riferimento per l'analisi delle micotossine?

La maggior parte delle micotossine sono prodotte da tre generi di funghi: Aspergillus, Penicillium e Fusarium. Un materiale di supporto viene inoculato con una sospensione fungina e incubato per diverse settimane. Durante il processo di fermentazione vengono prelevati dei campioni per confermare la creazione della micotossina target. I rendimenti tipici del processo di produzione sono di diversi grammi di micotossina grezza per kg di materiale di supporto e possono variare in modo significativo a seconda della micotossina e del processo di fermentazione in questione.

Una volta completata l'incubazione, inizia il vero lavoro: l'ingegnere di laboratorio purifica l'estratto grezzo molto grezzo. Inizia con processi di filtrazione ed estrazioni liquido-liquido per ridurre il peso e il volume dell'estratto e per rimuovere le impurità principali. Il processo chiave della purificazione consiste in fasi di purificazione cromatografica (semi)preparativa, in cui le impurità e i sottoprodotti vengono separati dal prodotto principale grazie al diverso comportamento di adsorbimento nella colonna cromatografica. Questo lavoro richiede un alto grado di competenza ed esperienza, poiché ogni micotossina ha le proprie proprietà e il proprio comportamento di ritenzione. La pulizia si conclude con l'essiccazione del prodotto, la sua pesatura e l'ulteriore verifica della sua qualità.

Un uso specifico dei materiali di riferimento è quello di materiali di riferimento della matrice (o materiali di controllo della qualità), che consistono principalmente in una matrice di alimenti o mangimi contaminata da micotossine di origine naturale. Un esempio è il mais con deossinivalenolo. Questi materiali possono essere utilizzati come controllo di qualità per supportare l'analisi di specifici campioni di alimenti e mangimi.

4. Perché ha senso utilizzare materiali di riferimento marcati con isotopi per le micotossine?

Gli analisti che utilizzano la spettrometria di massa attribuiscono una grande importanza ai materiali di riferimento marcati con isotopi - con una giustificazione. Pensate a questi materiali come a dei "super materiali di riferimento" per la spettrometria di massa. Possono fare ciò che i materiali non marcati con isotopi possono fare e molto di più. Ad esempio, compensano gli effetti indesiderati, come la diminuzione dell'efficienza di estrazione, il basso recupero o il comportamento della matrice nell'analisi degli analiti; di conseguenza, sono essenziali nell'impostazione di qualsiasi procedura analitica. I materiali di riferimento marcati con isotopi sono prodotti come descritto sopra, con una differenza importante: gli atomi 12C sono sostituiti da atomi 13C. Pertanto, i prodotti marcati con isotopi hanno lo stesso comportamento fisico e chimico degli analiti non marcati. Vengono aggiunti prima dell'analisi e subiscono la stessa procedura, ma compensano qualsiasi sovrastima o sottostima delle micotossine non marcate.

5. Come si controlla la qualità dei materiali di riferimento?

La purezza, cioè la qualità del prodotto, è di fondamentale importanza e dovrebbe essere la più alta possibile, o superiore al 95%. Mentre i prodotti ricorrenti possono essere confrontati con il lotto precursore per verificarne la qualità, un nuovo prodotto deve essere sottoposto a una caratterizzazione molto più completa. Questo tipo di caratterizzazione per i materiali solidi può coinvolgere diversi metodi altamente selettivi e sensibili: la determinazione della struttura mediante spettrometria di massa, la spettroscopia a infrarossi o la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare possono informarci su eventuali impurità intrinseche.

In ogni caso, la purezza deve essere determinata nel modo più accurato e preciso possibile. La disponibilità di un materiale di riferimento certificato può essere un enorme vantaggio, in quanto consente di tracciare direttamente il proprio materiale di riferimento (vedere il numero 6). Oggi, il metodo standard per determinare la quantità di materiali di riferimento liquidi di micotossine (materiali solidi disciolti in un solvente) è la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) collegata a un rilevatore appropriato, come l'UV (ultravioletto) o l'FLD (rilevamento a fluorescenza). Questo metodo ha un'applicabilità quasi universale, in quanto la maggior parte delle micotossine è sensibile ai raggi UV/FLD.

Nelle sostanze marcate con isotopi, la proporzione tra 13C e 12C (nota anche come modello isotopico) può essere determinata mediante una scansione a risoluzione avanzata con uno spettrometro di massa; la purezza isotopica del 13C deve essere superiore al 98%.

I laboratori che determinano le proprietà di un materiale di riferimento devono essere accreditati secondo la norma ISO 17025 ("Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e calibrazione"). Poiché i laboratori certificati ISO 17025 soddisfano il requisito della tracciabilità metrologica, i loro risultati possono essere utilizzati per specificare un materiale di riferimento certificato.

6. Che cos'è un materiale di riferimento certificato?

Qui arriviamo al livello più alto di standardizzazione. Un materiale di riferimento certificato è caratterizzato da una procedura metrologicamente valida per la sua proprietà (come la purezza o la concentrazione in %) ed è accompagnato da un certificato che fornisce il valore certificato insieme all'incertezza calcolata di questo valore. Ciò significa che esistono differenze tra i materiali di riferimento e i materiali di riferimento certificati in termini di tracciabilità e incertezza. Nel lavoro quotidiano di un laboratorio, i materiali di riferimento sono tipicamente utilizzati. Se è necessario risalire a un materiale di riferimento, si può utilizzare come riferimento il materiale di riferimento certificato con la sua tracciabilità metrologica. Tuttavia, attualmente esistono materiali di riferimento certificati solo per alcune micotossine.

7. Come si legge il certificato?

Un certificato qualificato fornisce le informazioni necessarie sul materiale di riferimento. In genere include la descrizione del prodotto con numero di lotto e data di scadenza, il fornitore con l'indirizzo, l'avviso di pericolo, l'uso previsto, le istruzioni per l'uso corretto, le condizioni di conservazione e, soprattutto, il valore di riferimento.

La data di scadenza si applica al prodotto non aperto nelle condizioni di conservazione definite. Per i materiali di riferimento certificati, il certificato documenta alcune ulteriori caratteristiche: il valore certificato, il budget di incertezza e la discussione sulla tracciabilità metrologica. L'incertezza viene calcolata in base a fattori quali la purezza e la preparazione del prodotto e, se non trascurabile, la sua stabilità e omogeneità (per maggiori informazioni sul calcolo e l'utilizzo dei valori di incertezza, consulti l'articolo "Alcune incertezze"). Il valore certificato viene confermato da un'analisi in cui la calibrazione viene effettuata rispetto a un lotto di riferimento dell'analita target preparato in modo indipendente.

1 CE n. 1881/2006.