Oltre i test allergologici basati sull'immunologia
La maggior parte dei kit disponibili in commercio per i test sugli allergeni alimentari si basa sull'applicazione di metodi immunologici come l'ELISA o i dispositivi a flusso laterale (strip test). Per eseguire l'ELISA, è necessario personale qualificato, ma è possibile analizzare numerosi campioni in parallelo, utilizzando piastre per microtitolazione a 48 o 96 pozzetti. In generale, l'analisi può richiedere da 30 minuti a qualche ora. Attualmente, l'ELISA è il metodo più applicato per il rilevamento e la quantificazione degli allergeni alimentari. Tuttavia, sebbene sia possibile analizzare molti campioni contemporaneamente, questi campioni possono essere testati per un solo analita.
Limitazioni da considerare
A causa dell'elevata specificità degli anticorpi verso una sola particolare proteina allergenica e delle limitazioni tecnologiche, è necessario utilizzare un kit separato per ogni allergene. Inoltre, l'alto grado di specificità verso un solo allergene potrebbe portare a risultati falsi negativi. Le fasi di lavorazione degli alimenti, come il trattamento termico, l'aggiunta di composti acidi o la fermentazione, possono modificare la struttura della proteina target. Questi allergeni modificati possono perdere le loro proprietà immunologiche e il complesso anticorpo-proteina target non può più formarsi. Questo porta a risultati falsi negativi o a quantificazioni ridotte. I test a striscia sono economici, molto facili da usare, non richiedono attrezzature di laboratorio e forniscono risultati solitamente in pochi minuti. Tuttavia, la maggior parte dei test su striscia sono solo qualitativi e si basano sugli anticorpi come elementi di riconoscimento. Pertanto, soffrono degli stessi problemi dei test ELISA con gli alimenti altamente elaborati. Negli ultimi anni, sono stati creati metodi di analisi alternativi per superare almeno alcune delle limitazioni dei sistemi di test basati sull'immunologia.
Rilevamento degli allergeni con il DNA
La PCR (reazione a catena della polimerasi) è un metodo relativamente veloce ed economico per identificare il DNA. Questa tecnologia, sviluppata negli anni '80, è migliorata continuamente da allora. La PCR è stata utilizzata per molti anni nei settori della diagnostica medica, della medicina legale, del monitoraggio ambientale e della quantificazione degli organismi geneticamente modificati negli alimenti e nei mangimi. All'inizio degli anni 2000, la PCR è stata applicata per la prima volta per identificare il DNA di allergeni alimentari comuni come la nocciola e l'arachide. Finora sono stati pubblicati i saggi PCR per la maggior parte degli "otto grandi" statunitensi e per i 14 allergeni alimentari dell'UE. La PCR amplifica piccoli frammenti di un DNA target, fino ad ottenere un numero sufficiente di copie per la visualizzazione o la quantificazione. Moltiplicando il target analitico per un fattore da 107 a 109, le poche molecole di DNA allergenico ottenute potrebbero essere sufficienti per individuare con successo gli ingredienti allergenici. Inizialmente sviluppata come metodo qualitativo, la PCR è stata successivamente modificata per diventare uno strumento di analisi quantitativa mediante l'applicazione di diversi coloranti o sonde generatrici di fluorescenza. Il fatto che la PCR rilevi la molecola di DNA estremamente stabile potrebbe essere un vantaggio quando si analizzano alimenti altamente lavorati. Il DNA tende ad essere inalterato anche in condizioni estreme e può quindi essere rilevato anche quando la maggior parte delle proteine è già stata degradata o modificata in qualche modo. Inoltre, la PCR può essere utilizzata per allergeni come il sedano, che non possono essere rilevati dagli anticorpi. Il sedano deve essere etichettato nell'UE, ma finora tutti i tentativi di produrre anticorpi affidabili sono falliti a causa della stretta relazione tra il sedano e altre piante come prezzemolo, carota, coriandolo o finocchio. Nell'ultimo decennio, sono state sviluppate nuove tecniche di rilevamento del DNA. Tutti questi cosiddetti metodi di amplificazione isotermica sono in qualche modo correlati alla PCR convenzionale, ma possono essere eseguiti quasi senza alcuna strumentazione. Per amplificare il DNA target si utilizza un semplice blocco di riscaldamento e la successiva rilevazione visiva avviene tramite coloranti fluorescenti. L'amplificazione isotermica è solitamente più veloce della PCR, meno soggetta a impurità co-isolate e in molti casi anche più sensibile.
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Allergeni alimentari
Perché le tecniche del DNA potrebbero fallire
Sebbene il rilevamento del DNA dei composti alimentari allergenici possa presentare alcuni vantaggi rispetto ai metodi basati sull'immunologia, questo approccio soffre di alcuni gravi inconvenienti. Poiché il DNA è l'analita di elezione per la PCR, è difficile/impossibile discriminare tra l'uovo o il latte e il corrispondente DNA tissutale di pollo o mucca, che condividono un DNA identico. Alcuni campioni, come l'albume d'uovo o il latte, contengono solo quantità minime di DNA, ma molte proteine allergeniche; pertanto, questo metodo non è adatto per analizzare questi tipi di campioni.
Spettrometria di massa: una tecnologia di alto livello
Una tecnologia ancora più recente per rilevare e quantificare gli allergeni è la spettrometria di massa, un metodo high-tech che identifica proteine e peptidi con un livello di precisione molto elevato. I primi tentativi di applicare questa tecnologia al rilevamento degli allergeni sono iniziati alla fine degli anni '90, ma la maggior parte dei risultati sono stati pubblicati solo negli ultimi anni. Il vantaggio principale dell'utilizzo di questa tecnologia per i test sugli allergeni è l'alto livello di fiducia e affidabilità. Gli strumenti hanno la capacità di rilevare più peptidi per proteina. Idealmente, per ogni allergene vengono analizzati da due a tre frammenti di peptidi. Il vantaggio di questo approccio è che anche se le proteine sono parzialmente degradate o modificate a causa delle condizioni di lavorazione degli alimenti, la probabilità di trovare almeno un frammento intatto è piuttosto alta. Questi peptidi marcatori sono selezionati da banche dati o dalla letteratura e devono essere altamente specifici per gli allergeni da quantificare. Inoltre, sono scelti per essere resistenti alle alterazioni della lavorazione degli alimenti. Questa strategia di riconoscimento multi-peptidico dell'allergene non è possibile con i saggi basati sull'immunologia. Gli anticorpi di solito si legano solo ad un particolare frammento (immunogenico) dell'allergene. Se questo piccolo frammento viene modificato, il riconoscimento del bersaglio potrebbe essere ostacolato. Inoltre, la spettrometria di massa è in grado di misurare diversi allergeni in parallelo. Questi metodi multi-analitici sono diventati particolarmente popolari negli ultimi anni. Questa strategia innovativa consente di analizzare numerosi allergeni da una singola estrazione di un campione in un unico ciclo di analisi. La procedura di estrazione per l'analisi con spettrometria di massa è più laboriosa rispetto ad altri approcci. Innanzitutto, il campione viene mescolato con un tampone di estrazione che spesso contiene ditiotreitolo o urea, per creare un ambiente riducente che rompe i legami disolfuro delle proteine. Il residuo del campione viene poi rimosso mediante centrifugazione e le proteine linearizzate vengono scisse con enzimi di digestione. Sono necessarie alcune ore o una notte per tagliare le proteine allergeniche con questi enzimi in piccoli frammenti peptidici. Sebbene le fasi preparatorie richiedano molto tempo, la soluzione peptidica risultante può essere analizzata per diversi allergeni in parallelo, utilizzando lo spettrometro di massa. Gli attuali metodi multipli possono quantificare fino a sette allergeni in parallelo, ma si può prevedere che questo numero possa aumentare drasticamente nei prossimi anni. I metodi multi-analitici per le micotossine sono iniziati con pochi analiti solo una decina di anni fa e oggi, i progetti di analisi più avanzati sono in grado di analizzare più di 400 tossine in parallelo.
Il metodo migliore?
La spettrometria di massa può probabilmente essere considerata il metodo di analisi degli allergeni con il maggior potenziale di miglioramento futuro, grazie alla sua straordinaria affidabilità, sensibilità e alla possibilità di eseguire analisi multi-allergene.
Tuttavia, non esiste un approccio privo di inconvenienti. La spettrometria di massa richiede personale altamente qualificato e i costi di investimento iniziale sono elevati a causa della strumentazione costosa. Inoltre, il tempo per ottenere un risultato sarà sempre molto più lungo rispetto ai metodi immunologici.
Non c'è un metodo unico
Il metodo perfetto, un gold standard per la quantificazione degli allergeni, non esiste. Gli ELISA e gli LFD sono i metodi preferiti per la maggior parte delle applicazioni industriali. I risultati possono essere ottenuti in tempi relativamente brevi, i costi sono da moderati a bassi e il personale può essere facilmente formato all'uso di questi test. Per alcuni problemi, come il materiale di analisi altamente lavorato o gli analiti specifici, la PCR potrebbe portare a risultati migliori. La spettrometria di massa si trova all'estremità superiore delle tecnologie disponibili, ma è ancora agli inizi per i test sugli allergeni. Tuttavia, negli ultimi anni è diventata il metodo preferito per molte altre sfide analitiche. Si può prevedere che questa tecnologia possa ricevere un impulso nel campo dell'analisi degli allergeni nel prossimo futuro.