Le sfide dei test sugli allergeni - Spiking e recuperi

Quando ho iniziato a sviluppare i test immunologici per il rilevamento degli allergeni negli alimenti, la prima cosa che mi ha colpito è stata l'ampia gamma di tipi di alimenti o matrici diverse con cui i test dovevano lavorare. Provenendo da un background di immunodosaggio medico, c'era un numero limitato di matrici diverse con cui lavorare. Nel mio caso, si trattava di siero di sangue. Con gli alimenti c'è una gamma quasi infinita di tipi di campioni diversi, ognuno con le proprie proprietà specifiche.

Come scegliere il kit di analisi giusto?

Quindi, come possiamo garantire che il kit di analisi prodotto sia adatto all'uso con una gamma di campioni così varia e impegnativa? Qui entra in gioco la validazione del campione. Il processo prevede l'aggiunta di una quantità nota di un allergene di interesse alla nostra matrice (spike) e poi il tentativo di recuperare l'allergene (recupero). Una cosa importante da ricordare è che, come dice il nome, i test immunologici utilizzano componenti biologici (anticorpi) per ottenere il rilevamento delle proteine allergeniche di interesse. Come per tutti i sistemi biologici, i kit sono sensibili agli estremi. Nel caso degli alimenti, i kit potrebbero non funzionare come dovrebbero in presenza di acidi o alcali forti, sale elevato, grassi elevati, ecc. Molti di questi estremi possono essere contrastati durante il processo di estrazione. I kit utilizzano quindi un sistema tamponato per far fronte alle variazioni di pH e l'aggiunta del tampone al campione aiuta a ridurre e diluire alcuni degli altri problemi, come il sale e i grassi.

Il mio recupero è accettabile?

Quando si tratta di recuperare una quantità nota di allergene da una matrice di campione, che cosa si ritiene accettabile? Prima di rispondere a questa domanda, dobbiamo definire il punto di partenza. Si tratta di un campione prelevato o di uno spiked?

I campioni incorsi sono definiti come campioni in cui una quantità nota di allergene alimentare è stata incorporata durante la lavorazione, imitando il più possibile le condizioni reali in cui la matrice del campione viene normalmente prodotta.

Il tema dei campioni sostenuti sarà trattato in modo più approfondito in un numero successivo di Spot On. In questo articolo, mi concentrerò sulla descrizione di un metodo più accessibile, che consiste nell'introdurre una quantità nota di allergene in una matrice ricevuta dal fornitore o dal produttore e nel misurarne il recupero.

Per quanto riguarda il recupero, la guida afferma che:

"I livelli ideali di recupero percentuale vanno dall'80 al 120%. I livelli di recupero sono influenzati sia dall'efficienza della fase di estrazione che dalla procedura ELISA.

"Con i metodi ELISA per gli allergeni alimentari, questo livello di recupero non è sempre possibile, soprattutto quando si analizzano alcune matrici difficili. Inoltre, il recupero da campioni sostenuti può essere sostanzialmente diverso da quello ottenuto utilizzando campioni con spike.

"Per questo motivo, i recuperi tra il 50 e il 150% saranno considerati accettabili, purché si possa dimostrare che sono coerenti".

Le linee guida sono state pubblicate nel 2010 dall'Associazione delle Comunità Analitiche (AOAC) con particolare riferimento ai metodi ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) quantitativi. Molti dei punti chiave sono applicabili anche ai metodi LFD (Lateral Flow Device) qualitativi o semi-quantitativi.

La "scienza" alla base dello spiking

Quando riceviamo o incontriamo un nuovo tipo di alimento che non è stato testato in precedenza, intraprendiamo la convalida del recupero dei picchi per assicurarci che funzioni come dovrebbe con i nostri kit di analisi. Effettueremo il picco a tre diversi livelli di allergene - basso, medio e alto - per coprire la gamma di rilevamento del test.

Il picco di allergene basso sarà vicino al Limite Inferiore di Quantificazione, LLOQ, dell'ELISA (in questo caso il calibratore di valore più basso sopra 0 ppm) o vicino al Limite di Rilevazione, LOD, di un dispositivo a flusso laterale. Il picco medio si troverà al centro della curva di calibrazione ELISA e il picco alto si troverà in corrispondenza o in prossimità del Limite Superiore di Quantificazione, ULOQ (il calibratore con il valore ppm più alto). Il campione viene estratto e analizzato in base all'inserto del prodotto fornito con il kit.

Quindi, ad esempio, se facciamo un picco di 5 ppm di mandorle nel cioccolato, ci aspettiamo di vedere un recupero da 4 ppm a 6ppm. Se il risultato non rientra in questo intervallo, si possono adottare delle misure per migliorare il recupero. Per esperienza, il cioccolato è una delle matrici alimentari più difficili da testare: è ricco di tannini e altri polifenoli che possono legarsi a qualsiasi proteina allergenica presente e formare complessi insolubili difficili da estrarre.

Tali difficoltà possono essere superate aggiungendo una proteina in più al tampone di estrazione. La proteina in eccesso si lega ai polifenoli e rende gli allergeni disponibili per l'estrazione. La mia proteina preferita è la gelatina di pesce, anche se è possibile utilizzare altri materiali, come il latte in polvere, per migliorare l'efficienza di estrazione dagli alimenti ad alto contenuto di polifenoli. Se si utilizza il latte in polvere, bisogna fare attenzione a non contaminare lo spazio del laboratorio, soprattutto se si eseguono test sugli allergeni del latte.

I dispositivi a flusso laterale, o strisce o dipstick, come vengono talvolta chiamati, possono essere convalidati per il recupero dei picchi in modo simile a un kit di test ELISA per allergeni. L'aspetto da tenere presente quando si sceglie un livello di picco elevato è che, sebbene gli LFD siano in grado di rilevare livelli di ppm molto elevati, si può effettivamente sovraccaricare il dispositivo aggiungendo una quantità eccessiva di allergene. Ciò può verificarsi in quantità superiori all'1% dell'alimento allergenico.

Mantenere la qualità e la precisione del test

Può essere necessario che un produttore di kit lavori a stretto contatto con clienti che testano abitualmente matrici alimentari difficili. È importante verificare che il kit funzioni come dovrebbe e con soddisfazione del cliente. Questo può essere ottenuto, come descritto in precedenza, effettuando esperimenti di recupero di picchi di allergeni nella matrice problematica.

In alcuni casi può essere auspicabile modificare o cambiare il metodo standard del kit per soddisfare le esigenze del campione e/o del cliente; questo dovrebbe essere sempre intrapreso con la guida del produttore del kit, per garantire la qualità e la riproducibilità del kit di analisi.