Creazione di calibranti liquidi per micotossine: Uno sguardo dietro le quinte

I materiali di riferimento, o calibranti, descrivono sostanze o oggetti con uno o più valori di proprietà caratteristica definiti che vengono utilizzati come misura o come punto di riferimento per i metodi di misurazione. Data l'importanza della sicurezza dei consumatori per l'industria alimentare e dei mangimi, i test sulle micotossine prevedono l'utilizzo di materiali di riferimento per ottenere risultati accurati e affidabili.

Un pericolo sempre presente

Le micotossine sono metaboliti fungini secondari presenti in natura, tossici per gli animali e gli esseri umani. I funghi della muffa crescono nei campi e durante la conservazione. Presenti in quasi tutti i prodotti agricoli del mondo, sono state identificate più di 380 micotossine e la tossicità di ciascuna sostanza varia notevolmente. Le concentrazioni massime consentite di varie micotossine nelle materie prime vegetali come grano, frumento, mais - solo per citarne alcune - hanno costretto i produttori di materie prime a esaminare attentamente i loro campioni in un laboratorio analitico per essere sicuri della qualità dei loro prodotti.

Preparazione gravimetrica

Spesso, un fungo che cresce in condizioni ottimali - temperature sufficientemente calde, umidità elevata e un substrato adatto - può produrre micotossine. In laboratorio, la storia di un materiale di riferimento inizia con il tentativo di regolare le condizioni di crescita artificiali per ottenere rendimenti ottimali di micotossine. Questo include l'uso di un genere fungino adatto - poiché ogni fungo produce il proprio schema caratteristico di metaboliti, che possono essere diverse centinaia. La manutenzione dei ceppi fungini per la produzione è fondamentale. La loro vitalità e funzionalità sono costantemente monitorate, poiché ciò costituisce la base di tutte le attività per i processi di produzione del materiale di riferimento. Le muffe sono organismi viventi che possono mutare nel tempo, o addirittura degenerare e provocare una diminuzione delle rese di micotossine. Dopo un certo periodo di conservazione, possono formarsi nuovi metaboliti, che possono influenzare enormemente il processo di isolamento. I ceppi devono essere rinnovati regolarmente per contrastare mutazioni, impurità o altre caratteristiche indesiderate.

La prima fase, la fermentazione, si basa sul rendere l'ambiente di laboratorio letteralmente il più gustoso possibile per il fungo, per promuoverne la crescita. Anche i terreni ottimali variano da ceppo a ceppo, quindi vengono forniti componenti come sali e minerali come fonte di nutrimento. La muffa viene lasciata crescere per un certo periodo di tempo - da pochi giorni a qualche settimana - durante il quale il fungo metabolizza il suo terreno di coltura.

Dopo il completamento della fermentazione e un attento controllo del processo, la micotossina viene estratta dal materiale di coltura utilizzando un solvente organico adatto. A seconda della struttura molecolare, si può trattare di solventi organici polari o non polari. Durante la fermentazione, le muffe producono per lo più impurità oltre alla tossina di interesse, ad esempio altri metaboliti, coloranti, oli, ecc.

L'estratto grezzo risultante contiene spesso molte impurità. Durante l'isolamento o la purificazione, la micotossina viene avvicinata passo dopo passo alla purezza target di >98% attraverso varie applicazioni cromatografiche e preparative con diverse selettività. Alcune tossine hanno strutture molecolari favorevoli e possono essere cristallizzate da una soluzione supersatura di solventi organici polari o apolari. Ciò avviene, ad esempio, raffreddando la soluzione, facendo evaporare il solvente di cristallizzazione o mescolando diversi solventi di diversa polarità. Altre tossine possono essere rese in forma cristallina, in polvere, mediante liofilizzazione. Con la cristallizzazione, la purezza della tossina viene aumentata di nuovo, fino ad ottenere la purezza desiderata.

Controllo di qualità

HPLC, fotometro UV e HPLC-MS sono utilizzati per determinare/confermare la purezza della materia prima prodotta. A seconda della tossina, ciò può essere fatto, ad esempio, con la cromatografia liquida ad alte prestazioni in combinazione con il rilevamento a diodi, il rilevamento a fluorescenza o simili, con il fotometro UV (analisi qualitativa e quantitativa del composto) o con la cromatografia liquida ad alte prestazioni combinata con il rilevamento della spettrometria di massa. La MS è particolarmente necessaria per la determinazione sopra descritta della purezza isotopica (ad esempio > 98% di atomi 13C) delle micotossine marcate con isotopi 13C. I materiali di riferimento per le micotossine hanno una posizione di nicchia sul mercato. Pertanto, a volte è difficile trovare sostanze comparative che siano disponibili in commercio e che possano essere utilizzate per il controllo del processo durante la produzione e i controlli di qualità.

Consegna

Dopo aver superato il controllo di qualità finale, la micotossina solida viene liquefatta per essere utilizzata come materiale di riferimento liquido per le micotossine. La soluzione liquida del calibratore viene poi imbottigliata e viene creato un certificato di analisi, che indica il valore della proprietà e la sua incertezza, che accompagna ogni singolo calibratore.