Non i soliti sospetti: 5 lacune nel suo programma di monitoraggio ambientale

Anche i programmi di monitoraggio della pulizia e della disinfezione meglio pianificati hanno dei punti ciechi. Stefan Widmann esamina da vicino cinque delle lacune più probabili - e più pericolose - del suo programma di monitoraggio ambientale e spiega cosa sono, perché dovrebbe preoccuparsene e cosa può fare.

#1 Microrganismi vitali ma non coltivabili (VBNC)

Per molto tempo, i microbiologi hanno ritenuto che tutti i batteri che non riuscivano a crescere sui normali terreni di coltura fossero morti. Una ricerca successiva ha rivelato che esiste un terzo stato oltre a quello coltivabile e morto: quello vitale ma non coltivabile (VBNC).

In generale, i batteri nello stato VBNC non si moltiplicano, ma sono ancora vivi, come dimostra la loro attività metabolica. La cosa più rilevante per noi è il fatto che possono diventare coltivabili dopo la rianimazione e quindi proliferare negli alimenti. Inoltre, alcuni batteri patogeni non crescono in assenza di un ospite e hanno bisogno solo di sopravvivere negli alimenti fino all'ingestione per causare malattie.

Ci sono molte ragioni per cui i batteri possono passare allo stato VBNC; la fame, l'incubazione al di fuori dell'intervallo di temperatura ottimale per la crescita, le concentrazioni osmotiche elevate, i livelli di concentrazione di ossigeno o l'esposizione alla luce bianca sono solo alcune delle cause. I tratti specifici del ceppo batterico in questione determinano ciò che esattamente fa entrare i batteri in questo stato.

Perché dovrebbe preoccuparsi? Alcuni batteri in grado di entrare nello stato VBNC sono preoccupanti per la produzione alimentare. Sebbene non conosciamo ancora tutte le specie batteriche che possono diventare VBNC, ne conosciamo alcune che lo fanno; esse contano organismi indicatori (come Klebsiella aerogenes e Klebsiella pneumoniae), adulteranti (come Lactobacillus plantarume Lactococcus lactis) e patogeni (come Salmonella Typhimurium, Campylobacter coli o Listeria monocytogenes)tra i loro numeri.

Dopo averli identificati, dobbiamo ora chiederci se questi batteri possano tornare a uno stato completamente coltivabile e potenzialmente patogeno. I microbiologi sono stati per lungo tempo all'oscuro di questa domanda, poiché è difficile separare completamente i batteri VBNC da quelli coltivabili. I ricercatori hanno risolto questo problema, in parte, utilizzando un approccio statistico: diluiscono un numero elevato di batteri VBNC fino al punto in cui è quasi impossibile che rimangano batteri coltivabili. I batteri vengono poi contati dopo un periodo di tempo definito. Se si osservano alti gradi di crescita, l'unica conclusione possibile è che i batteri hanno lasciato lo stato VBNC e sono diventati coltivabili.

Un ulteriore corollario è che se possono tornare a uno stato coltivabile, possono anche diventare nuovamente patogeni. Ci sono esempi di questo fenomeno che porta a epidemie. Ad esempio, l'E. coli O157 VBNC è stato sospettato in un'epidemia in Giappone nel 1997, poiché il numero totale di E. coli era insignificante e i ceppi shigatossigeni come l'O157 potevano causare malattie in numeri molto bassi.

#2 Batteri anaerobi e microaerofili

I batteri anaerobi o, più in generale, i microrganismi anaerobi, possono essere suddivisi in tre gruppi: obbligati, aero-tolleranti e facoltativi. Come indicano i loro nomi, ognuno di essi ha dei requisiti speciali per quanto riguarda l'aria, o più precisamente l'ossigeno, che li circonda. Gli anaerobi obbligati, come il Clostridioides difficile, sono danneggiati dall'ossigeno e muoiono poco dopo l'esposizione. I batteri aero-tolleranti, come il Clostridium botulinum, non possono utilizzare l'ossigeno e non muoiono né crescono in sua presenza. Gli anaerobi facoltativi possono utilizzare l'ossigeno ma non ne hanno bisogno per crescere, come nel caso dell'E. coli. Esiste anche un gruppo di batteri microaerofili, come il Campylobacter, che hanno bisogno di ossigeno per crescere, anche se in quantità molto minori (1-2%) rispetto all'aria normale, ma possono essere inibiti in condizioni aerobiche.

Perché dovrebbe preoccuparsi? Diversi batteri patogeni hanno questi requisiti speciali di crescita. Attualmente, le specie di Campylobacter termotolleranti sono motivo di preoccupazione per i professionisti della salute pubblica. In media, un pollo su due è infetto da Campylobacter, rendendo la carne di pollame una delle cause più comuni di intossicazione alimentare. Nell'Unione Europea, le malattie causate dalle specie di Campylobacter sono due volte più frequenti di quelle causate dalla Salmonella. Del gruppo anaerobico, una specie di Clostridi come il C. botulinum è responsabile della malattia di origine alimentare nota come botulismo, spesso trasmessa attraverso il cibo in scatola (cioè povero di ossigeno), in cui il C. botulinum può prosperare e produrre il composto botulinico, che è tossico per gli esseri umani. Un'altra specie di Clostridi, la C. perfringens, è la fonte più comune di intossicazione alimentare negli Stati Uniti e in Canada e provoca sintomi come crampi addominali e diarrea. Il rischio di infezione da C. perfringens si correla in modo particolare con gli alimenti conservati o immagazzinati in condizioni di calore per periodi di tempo più lunghi, il che favorisce la loro crescita fino a raggiungere numeri infettivi (104 ufc/g).

#3 La grande anomalia del conteggio dei piatti

Alcune stime indicano che solo l'1% dei batteri può essere coltivato con le conoscenze e le tecniche attualmente a nostra disposizione. La "grande anomalia del conteggio delle piastre" è il termine che usiamo per descrivere l'osservazione che i conteggi delle cellule microscopiche sono significativamente più alti dei conteggi corrispondenti delle "unità formanti colonie" sulle piastre di agar. Un paio di esempi possono illustrare al meglio questo fenomeno: mentre il 50% dei microrganismi della flora orale può essere coltivato con piastre di agar, la maggior parte della flora gastrointestinale non può essere coltivata affatto. Le ragioni sono numerose, ma la comunità di organismi che circonda la specie in questione, compresi altri batteri, piante e animali, può svolgere un ruolo importante.

I metodi di conta aerobica su piastra si basano su terreni molto generici, che non supportano la crescita della maggior parte dei gruppi di batteri. Tecnicamente, questo non fa parte della grande anomalia della conta delle piastre, poiché alcuni batteri sono in grado di crescere su piastre di agar speciali in condizioni particolari (come le condizioni anaerobiche o microaerofile).

Perché dovrebbe interessarsi? La grande anomalia del conteggio delle piastre non pone problemi significativi nei test quotidiani, in quanto il conteggio delle piastre aerobiche per i microrganismi indicatori è specifico per un determinato ambiente di produzione e, in quanto tale, è sempre relativo a una linea di base stabilita per quell'ambiente di produzione. Tuttavia, i metodi su piastra richiedono molto tempo e un periodo di incubazione fino a tre giorni, a seconda del protocollo in vigore. Esistono metodi diretti che non richiedono una fase di coltivazione per contare i batteri; i microscopi forniscono una visione completa dei batteri, ma richiedono molto tempo. Mentre i metodi diretti come la citometria a flusso sono comuni negli impianti di trattamento delle acque, non sono comuni nell'industria alimentare.

#4 Batteri psicrotrofi

I batteri psicrotrofi possono crescere a temperature fino a 0°C, con temperature ottimali e massime di crescita superiori a 15°C. Ciò rende questi microbi particolarmente problematici per gli alimenti e le bevande, come la carne e il latte crudi, conservati a basse temperature per lunghi periodi di tempo. I gruppi di batteri psicrotrofi più comunemente presenti negli alimenti sono i generi Gram-negativi Pseudomonas, Aeromonas, Achromobacter, Serratia, Alcaligenes, Chromobacterium e Flavobacterium, nonché i generi Gram-positivi come Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptococcus, Lactobacillus e Microbacteria. Anche la Listeria monocytogenes e alcuni ceppi di Clostridium botulinum sono noti per essere in grado di proliferare alle temperature di refrigerazione.

Perché dovrebbe interessarsi? I batteri psicrotrofi sono adulteranti e possono diminuire significativamente la qualità e la durata di conservazione degli alimenti. Gli impianti di produzione e i serbatoi di stoccaggio refrigerati offrono un ambiente favorevole alla moltiplicazione di queste specie batteriche. Nel latte refrigerato, ad esempio, Pseudomonas fluorescens può produrre sia proteasi che lipasi. Pertanto, le specie appartenenti al genere Pseudomonas sono considerate tipicamente responsabili delle difficoltà tecnologiche, in quanto le proteasi e le lipasi che producono possono causare la degradazione del grasso e delle proteine del latte, conferendo al latte un colore grigiastro e un sapore amaro. Le specie di Pseudomonas sono i microrganismi più spesso responsabili del deterioramento della carne refrigerata conservata aerobicamente. È noto che le specie di Pseudomonas sono molto robuste e in grado di resistere a condizioni ambientali stressanti che inibirebbero la crescita di altri microrganismi di deterioramento. Nella carne cruda refrigerata e confezionata sottovuoto, la microflora è dominata nella maggior parte dei casi da batteri lattici psicrotrofi. Inoltre, la crescita di agenti patogeni durante la conservazione refrigerata potrebbe portare a gravi malattie.

#5 Biofilm

I microrganismi sono in grado di colonizzare le superfici formando una matrice polimerica in cui possono essere presenti più specie microbiche; questo è noto come biofilm. Le prove dimostrano che la capacità di formare e sopravvivere nei biofilm non è limitata a gruppi specifici di microrganismi. Infatti, la grande maggioranza dei batteri è in grado di formare biofilm. I biofilm possono quindi essere composti da monocolture o da diverse specie di microrganismi. Alcuni ricercatori hanno suggerito che la struttura complessa dei biofilm misti li rende più stabili e più resistenti ai prodotti chimici per la pulizia. La popolazione iniziale che si lega alla superficie può modificarne le proprietà, consentendo a quelle successive di aderire tramite l'associazione cellula-cellula; in alcuni casi, l'attaccamento di una seconda specie può aumentare la stabilità della popolazione del biofilm. Ad esempio, gli studi dimostrano che L. monocytogenes ha maggiori probabilità di aderire all'acciaio in presenza di Pseudomonas.

Perché dovrebbe interessarsi? I biofilm che si formano sulle attrezzature per la lavorazione degli alimenti e su altre superfici a contatto con gli alimenti agiscono come una fonte persistente di contaminazione, minacciando la qualità e la sicurezza generale dei prodotti alimentari, con possibili malattie di origine alimentare e perdite economiche. I microrganismi di deterioramento sono noti per essere responsabili di quasi un terzo delle perdite nelle catene di approvvigionamento alimentare, rendendo la prevenzione e il controllo dei biofilm una priorità nell'industria alimentare. I microrganismi che si formano o prosperano nei biofilm sono più resistenti alla disinfezione, rendendoli problematici in un'ampia gamma di industrie alimentari. Altri effetti dei biofilm, come la corrosione delle superfici metalliche, sono un'ulteriore preoccupazione critica nelle industrie alimentari. In entrambi i casi, la presenza di biofilm in una fabbrica alimentare mette a rischio la salute umana. Il grado di rischio dipende dalle specie batteriche che formano questa struttura vivente tridimensionale.

Come si possono colmare queste lacune? Il potenziale della citometria a flusso I produttori alimentari in genere non hanno molte opzioni a disposizione. Quelle che offrono un minimo di precisione, come la colorazione vitale in combinazione con il microscopio, possono quantificare i batteri VBNC, ma richiedono tempo e attrezzature speciali. Tutti i gruppi di batteri anaerobi e microaerofili - con la notevole eccezione degli anaerobi facoltativi - possono crescere sulle classiche piastre di agar, ma solo in presenza di livelli di ossigeno attentamente controllati.

Tuttavia, le piastre di agar non sono una panacea. Le piastre di agar sono in grado di contare solo circa l'1% delle specie batteriche conosciute e richiedono giorni per fornire risultati - fino a 10 giorni nel caso di batteri psicrotrofi. I metodi ATP, pur essendo veloci, non quantificano i batteri e sono di uso limitato per rilevare i batteri dai biofilm; i dati cinetici delle cellule planctoniche liberamente sospese non dovrebbero essere utilizzati come riferimento, poiché il rilascio di ATP è molto più basso per i biofilm. Inoltre, le tracce di ATP provenienti da residui alimentari o funghi possono facilmente oscurare l'ATP rilasciato dai batteri, poiché le cellule eucariotiche contengono 10 milioni di volte più ATP delle cellule procariotiche. Di conseguenza, i dispositivi ATP utilizzati per rilevare le biopellicole tendono ad avere un limite di rilevamento molto più alto, il che significa che non sono sensibili come lo sarebbero quando rilevano i batteri liberi.

Ognuno di questi cinque casi ha dimostrato quanto possa essere difficile rilevare i batteri e i residui sulle superfici della produzione alimentare; le carenze dei metodi di rilevamento più comuni, come la placcatura e i test ATP, sono tanto ostinate quanto ben documentate.

Cosa possono fare i produttori alimentari per colmare le lacune lasciate dai metodi culturali e dai test ATP? Nel prossimo articolo, il collega Cristian Ilea illustra il potenziale della citometria a flusso ad impedenza e del citometro a flusso CytoQuant®, una nuova soluzione che quantifica immediatamente i batteri e le particelle di residui sulle superfici.