Prevenzione dei risultati falsi positivi nei test sugli agenti patogeni

Costosi e noiosi da seguire, i risultati falsi positivi nel rilevamento dei patogeni possono essere minimizzati con i fagi che riducono la presenza di batteri a reazione incrociata nei test sui patogeni. I batteri a reazione incrociata possono causare risultati falsi positivi e inibire la crescita del patogeno in questione.

I risultati falsi positivi causano costi aggiuntivi per i produttori alimentari, oltre al tempo supplementare necessario per confermare i risultati. Secondo gli standard ISO/FDA/USDA, il processo di conferma dei risultati dei test inizia con lo stripping di piastre di agar selettivo dal campione presuntivamente positivo. Queste piastre di agar devono essere incubate per due giorni per dimostrare se si tratta di un campione realmente positivo, e incubate a una temperatura diversa da quella dei campioni di routine. Se un laboratorio non dispone di un incubatore aggiuntivo, l'incubatore principale deve essere messo da parte e regolato alla temperatura richiesta, il che significa tempi morti, in quanto l'incubatore non può essere utilizzato per gli arricchimenti. Un altro aspetto negativo della fase di conferma è che le piastre di agar selettivo costano. Poiché hanno una durata di conservazione molto limitata, è difficile tenerle in magazzino. In generale, i test falso-positivi richiedono tempo e denaro inutili.

Il problema dei falsi positivi

I risultati falsi positivi possono verificarsi con ogni metodo di rilevamento dei patogeni. Non importa se si tratta di una tecnologia basata sul DNA, sulla biochimica o sull'immunologia. Tutte hanno a che fare con lo stesso problema: maggiore sensibilità contro maggiore selettività. Un buon approccio consiste nell'eliminare i batteri a reazione incrociata prima del rilevamento, e a questo scopo si utilizzano gli antibiotici. Ma per la maggior parte delle applicazioni, gli antibiotici mancano di selettività.

Superare la sfida della selettività

I batteriofagi (o fagi) sono gli organismi più abbondanti nel nostro ambiente e sono presenti in gran numero nell'acqua, negli alimenti e in varie altre fonti. Sono stati scoperti dal biologo canadese Félix Hubert d'Hérelle nel 1917. Il loro nome significa "mangiatori di batteri", il che definisce in qualche modo ciò che fanno. I batteriofagi hanno un'elevata specificità dell'ospite, attaccandosi ai batteri. Il grande vantaggio dell'uso dei fagi è che sono innocui per l'uomo, gli animali e le piante. Infatti, gli esseri umani sono abitualmente esposti ai fagi attraverso il consumo di cibo o acqua, senza effetti negativi. I fagi possono essere definiti "i nemici naturali" dei batteri a cui sono specifici. Nella carne lavorata e nei prodotti a base di carne, ci sono circa 108 fagi per grammo. Un numero elevato di fagi è presente anche nel tratto gastrointestinale umano. Prima che gli antibiotici diventassero ampiamente disponibili, i fagi venivano utilizzati per trattare le infezioni batteriche.

Utilizzata per decenni

La cosiddetta terapia con i fagi è stata sviluppata negli Stati Uniti e nell'ex URSS. Anche mentre gli antibiotici venivano sviluppati nel mondo occidentale, l'ex blocco sovietico continuava la ricerca sulla terapia fagica. Nel periodo successivo alla guerra fredda, le attività di ricerca sui fagi sono proseguite in Georgia, dove vengono portate avanti ancora oggi. I fagi hanno una specificità molto elevata nei confronti dei batteri ospiti, una caratteristica che presenta applicazioni potenzialmente interessanti per gli alimenti e i mangimi, nonché per l'industria biotecnologica. Oggi, i fagi sono utilizzati come additivi per eliminare gli organismi patogeni negli alimenti, come strumento per rilevare i batteri o come supplemento nel sistema di terreni SELECT™ di Romer Labs, per ridurre o addirittura eliminare la flora batterica competitiva, consentendo alle specie batteriche patogene target di crescere a un livello rilevabile. Sono più selettivi degli antibiotici e i microbi non sviluppano alcuna resistenza.

Identificare i batteri cross-reattivi

Per identificare i fagi, che possono essere utilizzati nei terreni di arricchimento selettivi o in altre applicazioni per inibire o addirittura uccidere i batteri competitivi, la domanda chiave è: come posso iniziare a trovarli? Il modo migliore per iniziare è osservare i campioni di alimenti o mangimi, perché questi materiali di prova contengono batteri che dovrebbero essere inibiti durante l'arricchimento. I ceppi di batteri che sono lontani dal patogeno ricercato non sono il bersaglio dei fagi, ma i ceppi che sono strettamente correlati al patogeno bersaglio potrebbero causare risultati falsi positivi.

Transgenico? Niente affatto!

Dopo aver identificato i batteri di fondo a reazione incrociata, il passo successivo è la ricerca di un fago che possa agire contro di essi. I fagi si trovano ovunque, ad esempio nelle acque reflue grezze, nelle acque di superficie, negli alimenti e nell'ambiente agricolo. Il modo più semplice per estrarli, se si tratta di una matrice venduta, è la centrifugazione. In questo modo, i fagi rimarranno nel surnatante, mentre altri componenti come i batteri formeranno un pellet sul fondo del contenitore. Questo surnatante contiene una miscela eterogenea di diversi fagi. Successivamente, i diversi fagi vengono isolati e si dovrà determinare l'ospite batterico che infettano. Questo può essere fatto con la cosiddetta tecnica "soft agar overly" o con il semplice spotting". In questa tecnica, un prato di batteri viene sovrapposto a una piastra di agar tradizionale e i sovranatanti dei fagi vengono spottati sul prato batterico. Dopo un'incubazione notturna, i fagi creano delle placche (o zone di schiarimento), che sono visibili ad occhio nudo. Le placche sono zone in cui i fagi hanno ucciso i batteri mediante una reazione litica. Ora, i cloni fagici possono essere isolati dall'agar, il che significa che sono tutte copie dello stesso ceppo fagico.

Come aiutano i fagi

Ora è il momento di trovare i fagi migliori per uccidere i batteri a reazione incrociata negli arricchimenti di patogeni. Ciò si ottiene testando i fagi contro i batteri a reazione incrociata e contro il patogeno target. Si preferisce un formato microtiter per minimizzare i costi e velocizzare i test. Una reazione litica visibile in un pozzetto indica che il fago è efficace contro i batteri. Dopo diverse prove di laboratorio, si possono finalmente identificare i fagi adatti: si tratta di fagi che inibiscono la crescita di ceppi batterici strettamente correlati e che allo stesso tempo non influenzano la crescita del patogeno target. Questi fagi possono poi essere utilizzati per eliminare i batteri a reazione incrociata nei sistemi di test di rilevamento dei patogeni, riducendo l'incidenza di segnali falsi positivi in un programma di monitoraggio dei patogeni e risparmiando così molto denaro e tempo.