Tecnologie di test rapidi per l'igiene ambientale: Uno sguardo più approfondito

Le tecnologie di analisi ambientale comunemente utilizzate si dividono in due approcci generali: analisi per i residui e analisi per i microrganismi. Qui analizziamo le diverse tecnologie all'interno di ciascun approccio, il loro funzionamento e la loro applicabilità e i loro vantaggi.

Test sui residui

Metodi ATP

L'adenosina trifosfato (ATP) è un nucleotide utilizzato nelle cellule come coenzima per fornire energia. Può essere considerato come l'"unità di valuta" molecolare per il trasferimento di energia all'interno di tutte le cellule viventi. L'energia è necessaria per tutte le attività cellulari, compresa la sintesi delle proteine e delle membrane, il movimento cellulare e la divisione cellulare. L'energia viene trasferita quando l'ATP si scinde in adenosina difosfato e adenosina monofosfato. L'idrolizzazione dei legami covalenti dei fosfati libera energia che viene utilizzata per le reazioni.

I sistemi di test ATP commerciali sfruttano la reazione luciferina/ luciferasi, molto comune in natura, per generare luce visibile con l'energia fornita dall'ATP. Più luce viene emessa, più ATP è presente, il che indica una maggiore quantità di residui alimentari o di microrganismi. Tuttavia, c'è un'avvertenza importante: poiché questi sistemi sono ampiamente utilizzati per la convalida dell'efficienza di pulizia, nella reazione sono comunemente coinvolti anche i disinfettanti. Questi disinfettanti possono disturbare le pareti cellulari dei microrganismi, ma preservano il loro ATP, il che significa che potrebbe non esserci una vera correlazione tra gli organismi viventi presenti sulla superficie e i risultati della misurazione dell'ATP.

I metodi ATP presentano un ulteriore potenziale svantaggio: la loro applicabilità varia a seconda del residuo alimentare da rilevare. Ad esempio, il test ATP non si presterebbe a testare la farina di frumento, in quanto si tratta di una matrice altamente lavorata che lascia poco ATP nei suoi residui. I residui di prodotti a base di carne, invece, contengono alti livelli di ATP.

Metodi di rilevamento delle proteine totali

Come altro approccio di analisi dei residui, i metodi di rilevamento delle proteine totali non analizzano i microrganismi in sé, ma piuttosto gli aminoacidi, i peptidi e le proteine. Questi test sono molto veloci e forniscono risultati entro un minuto. La rilevazione non è abbastanza sensibile per individuare le proteine dei microrganismi unicellulari. Pertanto, un risultato negativo con questo tipo di test non indica l'assenza del microrganismo. Inoltre, non c'è modo di rilevare agenti patogeni specifici con questo metodo. Tuttavia, i kit di test per il rilevamento delle proteine hanno la loro utilità, in quanto possono fornire indicazioni sull'efficienza della pulizia in modo rapido e conveniente.

Test sui microrganismi

Metodi culturali cromogenici

Questi sono i metodi tradizionali per monitorare l'igiene dell'ambiente di lavorazione. I metodi culturali sono trattati nella norma ISO 18593, "Microbiologia della catena alimentare - Metodi orizzontali per il campionamento delle superfici". Si possono utilizzare terreni non selettivi e selettivi per rilevare organismi specifici.

Metodi basati sull'agar cromogenico

In genere, esistono due modi per condurre i metodi basati sull'agar: direttamente o indirettamente attraverso una fase di diluizione. Il vantaggio di entrambi è che forniscono risultati quantitativi.

Nei metodi diretti, l'agar delle piastre o dei vetrini viene premuto direttamente sulla superficie da campionare. Le piastre di contatto hanno la forma delle classiche piastre di Petri e in genere hanno una superficie di 25 cm². I dip-slides sono palette di agar bifacciali protette da un tubo di plastica e hanno una superficie di agar di 7-10 cm² su ciascun lato della paletta, che equivale a 14-20 cm². Questi sistemi non richiedono attrezzature aggiuntive e la procedura di campionamento è molto veloce. Tuttavia, l'area di campionamento con questo metodo è limitata.

I tamponi, i tessuti e le spugne sono strumenti per il campionamento indiretto. Dopo averli tamponati sulla superficie da testare, vengono diluiti in una soluzione tampone, che viene poi pipettata nelle tradizionali piastre di Petri e sparsa. L'area della superficie testata può essere molto più ampia e gli spazi stretti e le lacune possono essere testati con un metodo indiretto. Tuttavia, i metodi indiretti hanno uno svantaggio: ci sono più fasi di manipolazione e sono necessarie forniture aggiuntive. Per il rilevamento dei patogeni, lo standard ISO raccomanda una superficie compresa tra 1000 cm² e 3000 cm²; un'area così grande può essere gestita solo con spugne o panni tampone.

Metodi di rilevamento basati su terreni liquidi cromogenici

Questo metodo culturale viene utilizzato solo per rilevare ma non per contare organismi specifici o gruppi di organismi, perché non fornisce risultati quantitativi. Nei metodi basati sui mezzi liquidi, si utilizzano dei tamponi per prelevare i campioni, che vengono poi inseriti in provette riempite con mezzi selettivi. In media, l'incubazione richiede almeno 48 ore per i risultati negativi presuntivi. I campioni positivi sono identificati da un cambiamento di colore o dalla florescenza a una specifica lunghezza d'onda del campione arricchito. Questi test sono generalmente facili da usare e convenienti.

Lo svantaggio dei sistemi basati su terreni liquidi è il loro basso grado di sensibilità, risultato di terreni altamente selettivi, che sopprimono intenzionalmente la crescita di altri batteri. In questo caso c'è un certo rischio: i batteri nell'ambiente di lavorazione sono già stressati e possono morire se i terreni di arricchimento sono troppo selettivi. D'altra parte, se la selettività è troppo bassa, può essere difficile rilevare microrganismi specifici utilizzando solo i terreni liquidi selettivi. L'interpretazione dei risultati può diventare difficile e soggettiva, poiché il cambiamento di colore o la florescenza non sono sempre abbastanza forti da indicare un risultato definitivo. Il vantaggio principale dei metodi basati sui terreni liquidi è che sono facili da usare e convenienti.

Metodi basati sul DNA

Esistono tre diversi metodi basati sul DNA: l'amplificazione isotermica del DNA, la PCR in tempo reale e quella tradizionale. La PCR in tempo reale è un metodo consolidato per il rilevamento di DNA o RNA, mentre l'amplificazione isotermica è una tecnologia più innovativa. Ci sono chiari vantaggi nell'utilizzare l'amplificazione isotermica rispetto alla PCR in tempo reale: ad esempio, l'amplificazione isotermica non richiede un termociclatore, poiché la reazione avviene a temperatura costante. Il metodo basato sul DNA più economico, ma anche più laborioso, è la PCR tradizionale, perché è necessario eseguire una fase di ibridazione o utilizzare un colorante piuttosto aspecifico dopo l'amplificazione per rilevare il DNA o l'RNA amplificato. In tutti i metodi, parti specifiche del DNA o dell'RNA vengono riconosciute da primer specifici e poi moltiplicate dall'enzima polimerasi. La sensibilità di questi metodi è notevolmente elevata e le regioni target del DNA o dell'RNA sono ben note. Il limite maggiore di questo sistema è che si tratta di un sistema basato sugli enzimi. Gli enzimi hanno bisogno di soluzioni tampone specifiche per funzionare correttamente. Gli ingredienti dei disinfettanti possono influenzare l'attività enzimatica, il che può portare a risultati falsi negativi. La tecnologia richiede anche molteplici fasi di micropipaggio, che possono essere una grave fonte di errore. Il vantaggio più grande dei metodi basati sul DNA è che si possono utilizzare terreni non selettivi per la fase di arricchimento, grazie all'elevata sensibilità del metodo. I terreni non selettivi sono accessibili, disponibili presso vari fornitori e richiedono il livello di biosicurezza più basso (livello 1). È anche possibile rilevare basse quantità di agenti patogeni sulle superfici ambientali senza arricchimento con i metodi basati sul DNA, ma la sensibilità è bassa rispetto a quella dei metodi basati sull'arricchimento. Infine, i risultati falsi positivi dovuti a frammenti di DNA di agenti patogeni già uccisi potrebbero rappresentare un problema importante.

Metodi immunologici

Gli immunodosaggi sono sistemi che utilizzano anticorpi per rilevare la presenza di microrganismi nelle soluzioni. Questi anticorpi possono legarsi agli antigeni, come i lipopolisaccaridi sulla superficie cellulare o la flagella di particolari microrganismi. Dopo una procedura di arricchimento singola o multipla che include terreni selettivi, i patogeni come le cellule di Listeria vengono rilevati con sistemi di analisi basati su anticorpi specifici. I test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) sono stati i primi a utilizzare la tecnologia immunologica per rilevare microrganismi specifici. L'ELISA consente di quantificare l'analita rilevato, ma la necessità di includere una fase di arricchimento impedisce di calcolare la concentrazione iniziale. Solo il personale qualificato può eseguire le molteplici fasi di trasferimento e lavaggio che gli ELISA richiedono. Lo sviluppo di dispositivi a flusso laterale, noti anche come strip test, ha risolto questo problema, rendendo la procedura di rilevamento immunologico molto più semplice e veloce ed eliminando il carico di lavoro dei test ELISA. Gli LFD con anticorpi selettivi, utilizzati in combinazione con terreni di arricchimento ad alte prestazioni, consentono di ottenere risultati rapidi e precisi, senza la necessità di apparecchiature costose o di costi legati alla formazione.

Conclusione

Scegliere la giusta tecnologia di analisi dell'igiene non è sempre un compito facile. Ci sono diverse considerazioni pratiche che influenzeranno la decisione: quanti siti di campionamento devono essere testati e quanto è importante la produttività del test? Come possono i tester ottimizzare il tempo per ottenere un risultato, dato che il test per alcuni batteri patogeni non viene condotto ogni giorno ed è più un compito di monitoraggio che una procedura di controllo della qualità? Sono necessari risultati quantitativi o sono sufficienti i test di presenza/assenza? Poiché non è ancora possibile ottenere la conta batterica subito dopo la pulizia, i produttori possono affidarsi a sistemi di analisi basati sull'ATP o sulle proteine, che possono servire come un vago indicatore della sicurezza di iniziare la produzione, ossia se l'ATP o le proteine sono presenti. Inoltre, le normative nazionali possono influenzare questa decisione. I metodi immunologici o basati sull'arricchimento del DNA sono superiori ad altri metodi in termini di sensibilità e selettività e dovrebbero essere i sistemi di scelta per il rilevamento dei patogeni. Per il rilevamento e il conteggio degli organismi indicatori o per il monitoraggio dell'igiene generale, si possono utilizzare sistemi più accessibili, come i dip-slides o i sistemi ATP.