Rivoluzione o mera evoluzione? Citometria a flusso e verifica della pulizia e disinfezione nelle strutture di produzione alimentare

La sicurezza alimentare dipende in gran parte dalle condizioni igieniche degli impianti di produzione alimentare. Livelli elevati di batteri di deterioramento possono compromettere la durata di conservazione e la qualità degli alimenti, mentre la presenza di agenti patogeni (come Salmonella e Listeria) può portare a gravi malattie. I produttori alimentari devono essere diligenti nel mantenere l'ambiente di lavorazione pulito e privo di microrganismi patogeni, per evitare la contaminazione incrociata del prodotto finale. Ma come viene fatto attualmente?

Ispezione visiva

Sebbene l'ispezione visiva sia un prerequisito, di per sé non è sufficiente. Si tratta di un mezzo soggettivo e impreciso per verificare la corretta pulizia. Inoltre, anche se una superficie non presenta residui apparenti, non significa che sia immacolata. L'ispezione visiva non può garantire che tutti i residui di cibo del ciclo precedente siano stati eliminati o che un disinfettante abbia ridotto efficacemente il livello microbico sulla superficie.

Enumerazione microbica con metodi basati sulla coltura

Questi sono i metodi tradizionali per monitorare l'igiene dell'ambiente di lavorazione. In genere, esistono due modi per eseguire il campionamento: quello basato sul contatto e quello basato sui tamponi. Con i metodi basati sul contatto, le piastre o i vetrini a immersione vengono posizionati sulla superficie da campionare e poi incubati. Il campionamento basato sul tamponamento viene effettuato con bastoncini o spugne che vengono risciacquati in una soluzione tampone, che viene poi inoculata in terreni sterili e incubata. Il limite principale di questi metodi tradizionali di determinazione microbica è la quantità di tempo necessaria per ottenere i risultati. Inoltre, la maggior parte delle specie di batteri non può essere coltivata su agar, un fenomeno noto come anomalia della conta delle grandi piastre.

Rilevamento dell'ATP

L'adenosina trifosfato (ATP) è un nucleotide che le cellule utilizzano per fornire energia. Può essere considerato come l'"unità di valuta" molecolare per l'energia all'interno di tutte le cellule viventi. L'energia viene trasferita quando l'ATP si scompone nel suo nucleoside e nel fosfato libero. L'idrolizzazione dei legami covalenti dei fosfati libera energia che viene utilizzata per le reazioni. I sistemi di test ATP commerciali sfruttano la reazione luciferina/luciferasi, molto comune in natura, per generare luce con l'energia fornita dall'ATP. Più luce viene emessa, più ATP è presente, il che potrebbe indirettamente indicare più residui alimentari o (potenzialmente) più microrganismi. Tuttavia, c'è un'avvertenza importante: poiché questi sistemi si basano su una reazione enzimatica, potenziali inibitori o condizioni ambientali non ottimali potrebbero generare risultati errati. La temperatura ambientale potrebbe aumentare i tempi di reazione, mentre la luce potrebbe rendere difficile ottenere letture corrette. Inoltre, i disinfettanti possono interferire con la reazione, il che significa che potrebbe non esserci una reale correlazione tra i batteri vivi presenti sulla superficie e i risultati della misurazione dell'ATP. Pertanto, i metodi basati sull'ATP sono normalmente utilizzati per testare le superfici prima dell'applicazione del disinfettante. I metodi ATP presentano un ulteriore svantaggio: la loro applicabilità dipende dalla natura degli alimenti trattati. La maggior parte degli alimenti lascia residui contenenti grandi quantità di ATP, che superano di diversi ordini di grandezza le quantità contenute nelle cellule batteriche. In pratica, ciò significa che i sistemi ATP non possono essere utilizzati per valutare la contaminazione microbica delle superfici nella maggior parte delle strutture di lavorazione degli alimenti. Sebbene non sia possibile contare direttamente i batteri, i sistemi ATP sono ampiamente utilizzati perché i risultati vengono generati in pochi secondi, un tempo di risposta disponibile in nessun'altra tecnologia comunemente disponibile fino ad ora.

Introduzione alla citometria a flusso

La citometria a flusso (FCM) si riferisce a un gruppo di tecniche che utilizzano segnali ottici o elettrici per rilevare e misurare determinate proprietà fisiche o chimiche di cellule e particelle sospese in un fluido. Quasi 300 studi condotti tra il 2000 e il 2018 hanno valutato la FCM come strumento per caratterizzare la qualità microbica dell'acqua. Questa ricerca è stata in grado di illustrare il valore della FCM nel trattamento, nella distribuzione e nel riutilizzo dell'acqua. Ora c'è un corpo di ricerca che documenta applicazioni di successo della FCM abbastanza solido da suggerire che potrebbe ragionevolmente e realisticamente vedere un'adozione diffusa come metodo di routine per la valutazione della qualità dell'acqua. Che cosa ha a che fare tutto questo con la valutazione dell'efficienza della pulizia e della disinfezione negli impianti di produzione alimentare? I metodi precedentemente diffusi per la determinazione della qualità dell'acqua erano spesso limitati dalla bassa sensibilità, dall'elevata necessità di manodopera e di tempo, dalla suscettibilità all'interferenza dei composti inibitori e dalla difficoltà di distinguere tra cellule vitali e non vitali. (Ma attenzione: i citometri a flusso a fluorescenza sono generalmente dispositivi ingombranti e costosi, che richiedono personale altamente qualificato per essere utilizzati.

La potenza della citometria a flusso in un dispositivo portatile

Per rendere la FCM una soluzione praticabile per la verifica della pulizia nelle strutture di lavorazione degli alimenti, è necessario che sia disponibile in un formato portatile semplice e facile da usare, ma sufficientemente preciso da fornire conteggi affidabili di batteri e particelle residue nei campioni ambientali. Ciò è stato reso possibile dall'uso della citometria a flusso ad impedenza. La citometria a flusso ad impedenza è un tipo specifico di citometria a flusso: invece di sistemi ottici come la tecnologia laser, i citometri a flusso ad impedenza impiegano una corrente alternata a frequenze variabili, che consente al dispositivo di rilevare e contare separatamente le cellule e le particelle residue. Mentre i citometri a flusso basati su sistemi ottici sono in grado di contare solo le cellule etichettate con coloranti, i citometri a flusso ad impedenza possono eseguire la stessa operazione senza bisogno di etichettatura. Rispetto ad altri dispositivi citometrici a flusso, sono compatti, portatili e alimentati a batteria, il che consente di utilizzarli dove viene prelevato il campione.

Come fanno i citometri a flusso ad impedenza a distinguere tra cellule e particelle residue?

Le proprietà elettro-magnetiche dei batteri consentono ai citometri a flusso di distinguerli da altre particelle. Il citoplasma e la membrana cellulare di un batterio modificano il campo elettrico in modi unici e identificabili. Mentre la corrente elettrica si muove attraverso le particelle metalliche per lo più senza ostacoli, le particelle non conduttive resistono al campo. I batteri intatti, tuttavia, assomigliano sia alle particelle non conduttive che a quelle conduttive: la membrana cellulare impedisce alle basse frequenze di penetrare, facendoli assomigliare a particelle non conduttive; alle alte frequenze, invece, la corrente elettrica penetra la membrana. I microelettrodi del citometro a flusso ad impedenza generano questi campi elettrici e consentono al dispositivo di quantificare le variazioni di conduttività e resistenza in termini di misurazioni separate di cellule intatte e particelle.

Applicazione della citometria a flusso ad impedenza alla sicurezza alimentare: l'introduzione di CytoQuant®.

Come accennato in precedenza, un vantaggio che i citometri a flusso ad impedenza hanno rispetto ad altri tipi di dispositivi citometrici è la loro portabilità. Leggeri, piccoli e alimentati a batteria, possono operare sul campo e nei punti di controllo critici dove l'igiene è una preoccupazione prioritaria. Il citometro a flusso ad impedenza CytoQuant® è progettato per essere utilizzato proprio in queste aree, tra cui gli impianti di produzione alimentare e le camere bianche. La citometria a flusso ad impedenza offre notevoli vantaggi ai produttori alimentari che desiderano verificare i loro programmi di pulizia e sicurezza alimentare: la quantificazione rapida e separata dei batteri e delle particelle di residui (che possono servire come indicatore dell'efficacia della pulizia), la sensibilità del metodo e la robustezza del kit di tamponamento e del citometro stesso. Il sistema CytoQuant® è facile da usare, in quanto il dispositivo gestisce tutto il lavoro, tranne il campionamento. Un test inizia con il tamponamento di un'area predefinita (ad esempio, 20 x 20 cm o 8 x 8 pollici) della superficie da testare. Prosegue posizionando il tampone in una provetta contenente una soluzione conduttiva proprietaria e poi agitando il kit di tamponi per sospendere i batteri. Quando si analizzano le acque di risciacquo, il campione viene inserito direttamente in una fiala vuota, quindi si aggiungono alcune gocce di soluzione elettrolitica. Dopo aver mescolato il campione, l'utente inserisce la fiala nel CytoQuant®. Due aghi penetrano nel fondo della provetta, collegando il liquido al sistema di flusso del dispositivo. Quindi, dopo che la soluzione è stata introdotta nel sistema di flusso, viene fatta passare dagli elettrodi nella cella di flusso. Dopo 30 secondi, il dispositivo registra risultati separati per batteri e particelle e li visualizza sullo schermo.

Rivoluzione o evoluzione?

Il citometro a flusso mobile CytoQuant® consente la verifica immediata e in loco delle procedure di pulizia e disinfezione negli impianti di produzione alimentare o in altre aree in cui l'igiene è fondamentale. Quantificando direttamente i batteri e le particelle residue sulle superfici, senza l'influenza negativa dei disinfettanti o della temperatura, offre vantaggi sostanziali rispetto ai dispositivi ATP, mentre il tempo di risultato di 30 secondi lo rende un perfetto potenziamento dei programmi di igiene che già utilizzano metodi culturali. Considerando l'enorme potenziale della citometria a flusso ad impedenza, a un certo punto potrebbe essere considerata alla pari o addirittura sostituire i metodi culturali come standard nella verifica della pulizia. Si tratterebbe di una vera e propria rivoluzione nel settore.