I 7 peccati dei test sugli OGM

L'uso di colture geneticamente modificate (GM) è in aumento in tutto il mondo. Questo presenta molte opportunità per l'industria agricola, mentre comporta molte sfide per il settore delle analisi. Un esperto di Romer Labs condivide le sue conoscenze sui test delle colture GM, in modo che lei possa evitare di commettere errori comuni nel suo laboratorio.

1. Identificare il bersaglio sbagliato

Fare i compiti a casa: questa è forse l'abitudine più elementare che ogni scienziato possa imparare. È particolarmente necessario per i test sugli organismi geneticamente modificati (OGM), dove fare i compiti a casa significa conoscere gli eventi che costituiscono gli obiettivi, in modo da evitare falsi positivi e risultati errati. Il problema riguarda i tratti. Un tratto è una proteina derivata da una modifica genetica che conferisce una caratteristica speciale alla pianta. Le modifiche genetiche possono essere presenti in diverse combinazioni che producono tratti simili o completamente diversi. Tra gli elementi più popolari delle modifiche genetiche ci sono i promotori (p35S, FMV), i terminatori (NOSt), i geni codificanti per alcuni tratti utili (cp4 epsps, pat, bar, Cry1A e altri) e i geni che codificano i marcatori selettivi (NPTII, PMI). I suoi tecnici devono considerare molti fattori diversi per definire l'obiettivo di qualsiasi analisi OGM. Assicuratevi di considerare il territorio da cui proviene il prodotto, nonché i possibili eventi, se questi eventi sono autorizzati nella regione in questione e se la pianta di interesse ha tratti biotecnologici disponibili in commercio. Può essere complicato: a volte la modifica esiste ma non è autorizzata o piantata in alcune regioni. Tuttavia, potrebbe essere ampiamente utilizzata in un'altra regione. Inoltre, ci sono stati casi di eventi non approvati che sono sfuggiti al contenimento e sono arrivati sul campo.

2. Scegliere un metodo difettoso o insufficiente

Può essere una decisione rischiosa: quale dovrebbe essere l'ambito di uno screening degli OGM? I laboratori possono concentrarsi su pochi elementi genetici o proteine, oppure possono ampliare l'ambito a diversi eventi o proteine, il che può essere costoso. Trovare il metodo più adatto alle sue esigenze e che garantisca risultati accurati è essenziale. I metodi basati sul DNA richiedono molto tempo e dipendono da un'estrazione del DNA di alta qualità e da controlli adeguati. Anche la variazione del numero di copie e la poliploidia possono causare problemi nei campioni e devono essere presi in considerazione quando si esegue l'analisi del DNA. Uno sguardo ad alcune piante comuni illustrerà il punto. Nel caso della soia, non è sufficiente analizzare solo i promotori e i terminatori, perché solo alcuni dei 15 potenziali eventi della soia contengono questi elementi genetici comuni. Il mais è una storia completamente diversa: un ampio screening per questi elementi è quasi del tutto sufficiente, perché la maggior parte degli eventi nel mais contiene questi elementi. Mentre i metodi basati sul DNA sono costosi e utilizzati solo nei laboratori di servizi analitici, l'identificazione delle proteine è relativamente economica ed è utile per lo screening dei tratti comuni in loco. La maggior parte degli eventi GM ha un proprio livello di espressione proteica modificata. Prestare attenzione quando si esegue l'analisi proteica della soia e della colza con le stesse strisce del dispositivo a flusso laterale (LFD). La Tabella 1 evidenzia i diversi tassi di espressione di CP4 EPSPS, rendendo necessario l'utilizzo di diversi metodi di rilevamento LFD nella soia e nella colza. L'approccio giusto utilizza diversi test e regola la sensibilità per le diverse materie prime per raggiungere un livello di rilevamento simile.

3. Non comprendere appieno i diversi gradi di sensibilità dei test

I metodi basati sul DNA sono molto sensibili e sono in grado di rilevare una singola copia del gene target. La sensibilità dei metodi basati sul DNA è limitata dal numero di semi analizzati. Di solito si tratta dello 0,01% o di un seme geneticamente modificato (GM) in un insieme di 10.000 semi non GM. Questa sensibilità è più che sufficiente per essere sicuri al 99,9% di qualsiasi livello specifico di rilevamento fino allo 0,1%. D'altra parte, i metodi basati sulle proteine hanno un limite di rilevamento (LOD) basso fino allo 0,1%, ovvero 1 seme GM su 1.000 semi non GM. Tuttavia, questa sensibilità non è sufficiente a garantire un risultato con il 99% di certezza. Il massimo che si può ottenere con un test su una singola proteina con un LOD dello 0,1% è un livello dello 0,46% con una confidenza del 99%. La distribuzione non uniforme dei semi nei campioni reali porta a questa discrepanza. Per avere la certezza al 99% che il livello di contaminazione OGM sia inferiore allo 0,1%, consigliamo di eseguire almeno quattro test su 1.000 chicchi con una sensibilità dello 0,1% ciascuno. Per una sicurezza del 95% allo 0,1%, esegua tre test su 1000 chicchi, tutti con risultati negativi.

4. Rimozione delle impurità o trattamento del campione

I laboratori di cereali spesso rimuovono le impurità dai campioni prima di condurre un test. Tuttavia, la purificazione dei campioni di OGM non è consentita. Se alcuni residui contenenti tracce di piante OGM rimangono nei campioni, devono essere rilevati. Ad esempio, se un campione di mais contiene alcuni residui di soia OGM (chicchi, gusci, polvere), il lavaggio e la pulizia manuale rimuoveranno questi residui e produrranno un risultato errato. Non sottoponga i campioni a nessun tipo di trattamento termico, nemmeno per asciugare l'umidità in eccesso. In particolare, per i metodi basati sulle proteine, ciò potrebbe provocare la denaturazione delle proteine del tratto e portare alla perdita completa della sensibilità del test, in quanto la proteina target sarebbe cambiata. Gli anticorpi utilizzati in queste applicazioni non sarebbero più in grado di riconoscere i loro bersagli.

5. Utilizzo di una procedura impropria per preparare il campione

Il metodo di isolamento del DNA deve essere progettato e seguito con attenzione per evitare la degradazione del DNA, che potrebbe falsare i risultati. Pertanto, è importante verificare la qualità e la quantità di DNA purificato. Oltre ai reagenti di estrazione del DNA utilizzati, anche il metodo di macinazione è molto importante. I mulini a lama danno i risultati migliori, in quanto macinano abbastanza finemente da consentire l'estrazione del DNA. Tuttavia, è indispensabile pulire accuratamente qualsiasi apparecchiatura di macinazione dopo l'uso, poiché la contaminazione incrociata è un problema enorme nei test sugli OGM. Un'apparecchiatura non adeguatamente pulita potrebbe produrre risultati falsi negativi nei lotti successivi. L'estrazione delle proteine richiede una macinatura più grossolana. È sufficiente schiacciare tutti i semi presenti nel campione. Se si macinano i semi troppo finemente, ci vorrà troppo tempo perché l'estratto si depositi e il campione conterrà troppe particelle solide, che si attaccheranno agli LFD e inibiranno il flusso del liquido. I mulini utilizzati per l'estrazione prima dell'analisi LFD devono essere impostati in modo da evitare di ottenere frazioni troppo fini. Anche la forma del recipiente di estrazione deve essere presa in considerazione: non deve essere piatta ed è meglio utilizzare recipienti monouso per evitare la contaminazione incrociata. I frullatori sono molto utilizzati per la macinazione per i test sulle proteine, perché sono molto facili da pulire, evitando così problemi di contaminazione incrociata.

6. Personalizzazione delle procedure di analisi o mancata lettura del foglietto illustrativo

Questo potrebbe essere il peccato più grave commesso dagli operatori. Mentre i laboratori di analisi di riferimento impiegano personale addestrato per tutto l'anno, i laboratori di cereali hanno spesso una politica di assunzione stagionale e quindi impiegano personale con minori competenze in materia di analisi. Questo potrebbe portare a una lettura errata della procedura di analisi, a una sua scorretta esecuzione o a una sua alterazione in laboratorio. Ciò può influire su tutte le parti del processo di analisi, a partire dall'estrazione e influenzando elementi di analisi come i volumi di liquido necessari per il test, i tempi di sviluppo e le procedure di analisi. Si assicuri di leggere attentamente tutte le confezioni e la documentazione prima di eseguire qualsiasi analisi, per garantire risultati affidabili.

7. Pulizia insufficiente dell'attrezzatura (causa di contaminazione incrociata)

Si assicuri che il mulino che utilizza per l'analisi degli OGM sia facile da pulire. Il modo migliore è utilizzare vasi e lame rimovibili, in modo da poterli pulire separatamente dal motore del mulino. Ogni componente dell'apparecchiatura deve essere lavabile. I frullatori sono comunemente utilizzati per macinare i campioni di OGM, perché sono facili da pulire. I mulini devono essere smontati e tutte le parti devono essere lavate separatamente. Lavare tutte le attrezzature con sapone liquido e poi risciacquare con acqua. Non utilizzare l'etanolo come detergente; il suo unico utilizzo è quello di accelerare il processo di asciugatura. Ogni laboratorio deve convalidare la propria procedura di pulizia per garantire l'efficienza. Raccomandiamo l'uso di guanti durante la manipolazione di tutti i campioni. Cambiare i guanti e lavarsi le mani tra un campione e l'altro aiuterà anche ad evitare la contaminazione incrociata. Si assicuri di pulire tutti gli strumenti che possono essere entrati in contatto con l'estratto di materiale macinato. Un'altra soluzione è quella di utilizzare il più possibile attrezzature monouso.