7 rzeczy, które koniecznie muszą Państwo wiedzieć o materiałach referencyjnych dotyczących mikotoksyn

Kwalifikowane materiały referencyjne są warunkiem wstępnym udanej kwalifikacji i kwantyfikacji w chemii analitycznej. Ale jak są one wytwarzane? Jak można mieć pewność, że spełniają one standardy jakości, których potrzebuje Państwa laboratorium? Czym są certyfikowane materiały referencyjne? Jak należy rozumieć certyfikat? Helmut Rost z Romer Labs odpowiada na te i inne często zadawane pytania.

1. Dlaczego potrzebujemy materiałów referencyjnych?

Krótka odpowiedź brzmi: organy regulacyjne i certyfikujące wymagają lub zalecają, aby laboratoria z nich korzystały. Na przykład Stany Zjednoczone i Unia Europejska1 regulują kilka mikotoksyn, ustalając najwyższe dopuszczalne poziomy tych zanieczyszczeń w paszach i środkach spożywczych. Ponadto laboratoria akredytowane zgodnie z normą ISO 17025 muszą stosować wykwalifikowane i kompetentne materiały referencyjne, aby utrzymać swoją akredytację.

Nieco dłuższa odpowiedź brzmi: laboratoria stosują materiały referencyjne, aby zwiększyć wiarygodność swoich wyników. W ostatnich dziesięcioleciach analiza zanieczyszczeń, takich jak mikotoksyny, stała się coraz ważniejsza dla charakterystyki i oceny próbek żywności i pasz. Materiały referencyjne to substancje o określonych właściwościach, takie jak aflatoksyna B1 rozpuszczona w acetonitrylu w stężeniu 2 µg/ml. Specyficzne właściwości materiału referencyjnego - i, co ważne, jego względna czystość - stanowią punkt odniesienia, dzięki któremu technicy laboratoryjni mogą potwierdzić dokładność własnych wyników.

2. Jak definiuje się materiał referencyjny?

Materiał referencyjny jest wystarczająco jednorodny i stabilny pod względem określonych właściwości; na przykład ma określony procent czystości mikotoksyny lub mikotoksyn w postaci stałej lub określone stężenie jako wzorzec płynny. Cechy te zapewniają ich przydatność do wykorzystania w procesie pomiarowym. Producenci materiałów referencyjnych spełniający wymagania normy ISO 17034:2016 ("Ogólne wymagania dotyczące kompetencji producentów materiałów referencyjnych") są uznawani za kompetentnych. Tekst normy ISO wymienia odpowiednie wymagania na kilkudziesięciu stronach wraz z dalszą literaturą.

Podsumowując, materiał kandydujący musi być dobrze scharakteryzowany pod względem tożsamości i czystości, zanim będzie mógł zostać wykorzystany jako starter jakiegokolwiek materiału referencyjnego. Plan produkcji zapewnia prawidłową dokumentację dla wszystkich produkowanych partii. Długoterminowe i krótkoterminowe testy stabilności w różnych temperaturach muszą wykazać, że materiał jest stabilny do określonej daty ważności. Test jednorodności dla każdej partii potwierdza, że materiał jest równomiernie rozprowadzony w naczyniach wysyłkowych. Wszystkie analizy muszą spełniać wymagania normy ISO 17025; akredytacja ISO 17034 oznacza, że laboratorium jest akredytowane zgodnie z normą ISO 17025 w zakresie metod analitycznych.

3. W jaki sposób produkowane są materiały referencyjne do analizy mikotoksyn?

Większość mikotoksyn jest wytwarzana przez trzy rodzaje grzybów: Aspergillus, Penicillium i Fusarium. Materiał nośny jest zaszczepiany zawiesiną grzybów i inkubowany przez kilka tygodni. Próbki są pobierane podczas procesu fermentacji, aby potwierdzić, że tworzona jest docelowa mikotoksyna. Typowa wydajność procesu produkcyjnego wynosi kilka gramów surowej mikotoksyny na kilogram materiału nośnego i może się znacznie różnić w zależności od mikotoksyny i danego procesu fermentacji.

Po zakończeniu inkubacji rozpoczyna się prawdziwa praca: inżynier laboratoryjny oczyszcza bardzo surowy ekstrakt. Zaczyna się od procesów filtrowania i ekstrakcji ciecz-ciecz w celu zmniejszenia masy i objętości ekstraktu oraz usunięcia głównych zanieczyszczeń. Kluczowy proces oczyszczania składa się z (pół)przygotowawczych etapów oczyszczania chromatograficznego, w których zanieczyszczenia i produkty uboczne są oddzielane od głównego produktu ze względu na różne zachowanie adsorpcyjne w kolumnie chromatograficznej. Praca ta wymaga wysokiego stopnia umiejętności i doświadczenia, ponieważ każda mikotoksyna ma swoje własne właściwości i zachowanie retencyjne. Oczyszczanie kończy się suszeniem produktu, ważeniem go, a następnie ponownym sprawdzeniem jego jakości.

Jednym ze szczególnych zastosowań materiałów referencyjnych są materiały referencyjne matrycy (lub materiały kontroli jakości), które składają się głównie z matrycy żywności lub paszy zanieczyszczonej naturalnie występującymi mikotoksynami. Jednym z przykładów jest kukurydza z deoksyniwalenolem. Materiały te mogą być stosowane jako kontrola jakości w celu wsparcia analizy określonych próbek żywności i pasz.

4. Dlaczego warto stosować materiały referencyjne znakowane izotopami dla mikotoksyn?

Analitycy stosujący spektrometrię masową przywiązują dużą wagę do materiałów referencyjnych znakowanych izotopami - z uzasadnieniem. Proszę pomyśleć o nich jako o "super materiałach referencyjnych" dla spektrometrii mas. Mogą one robić to, co materiały nieznakowane izotopami, a nawet więcej. Na przykład, kompensują niepożądane efekty, takie jak zmniejszona wydajność ekstrakcji, niski odzysk lub zachowanie matrycy w analizie analitów; w związku z tym są niezbędne przy opracowywaniu każdej procedury analitycznej. Materiały referencyjne znakowane izotopami są wytwarzane w sposób opisany powyżej z jedną ważną różnicą: atomy 12C są zastępowane atomami 13C. Dlatego produkty znakowane izotopami mają takie samo zachowanie fizyczne i chemiczne jak nieznakowane anality. Są one dodawane przed analizą i przechodzą tę samą procedurę, ale kompensują wszelkie zawyżone lub zaniżone wartości nieznakowanych mikotoksyn.

5. Jak sprawdzają Państwo jakość materiałów referencyjnych?

Czystość, czyli jakość produktu, ma ogromne znaczenie i powinna być jak najwyższa lub wyższa niż 95%. Podczas gdy powtarzające się produkty można porównać z partią prekursora w celu sprawdzenia ich jakości, nowy produkt musi zostać poddany znacznie bardziej kompleksowej charakterystyce. Ten rodzaj charakterystyki dla materiałów stałych może obejmować kilka wysoce selektywnych i czułych metod: określenie struktury za pomocą spektrometrii masowej, spektroskopii w podczerwieni lub spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego może poinformować nas o wszelkich możliwych zanieczyszczeniach.

W każdym przypadku czystość musi być określona tak dokładnie i precyzyjnie, jak to tylko możliwe. Dostępność certyfikowanego materiału referencyjnego może być ogromną zaletą, ponieważ umożliwia bezpośrednie śledzenie własnego materiału referencyjnego (patrz numer 6 poniżej). Obecnie standardową metodą określania ilości płynnych materiałów referencyjnych mikotoksyn (materiałów stałych rozpuszczonych w rozpuszczalniku) jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) połączona z odpowiednim detektorem, takim jak UV (ultrafiolet) lub FLD (detekcja fluorescencyjna). Metoda ta ma niemal uniwersalne zastosowanie, ponieważ większość mikotoksyn jest wrażliwa na promieniowanie UV/FLD.

W przypadku substancji znakowanych izotopami, stosunek 13C do 12C (znany również jako wzór izotopowy) można określić za pomocą skanowania o zwiększonej rozdzielczości za pomocą spektrometru masowego; czystość izotopowa 13C powinna być większa niż 98%.

Laboratoria określające właściwości materiału referencyjnego powinny być akredytowane zgodnie z normą ISO 17025 ("Ogólne wymagania dotyczące kompetencji laboratoriów badawczych i kalibracyjnych"). Ponieważ laboratoria posiadające certyfikat ISO 17025 spełniają wymóg identyfikowalności metrologicznej, ich wyniki mogą być wykorzystane do określenia certyfikowanego materiału odniesienia.

6. Czym jest certyfikowany materiał odniesienia?

Tutaj dochodzimy do najwyższego poziomu standaryzacji. Certyfikowany materiał referencyjny charakteryzuje się metrologicznie ważną procedurą dla swojej właściwości (takiej jak % czystości lub stężenia) i towarzyszy mu certyfikat, który podaje certyfikowaną wartość wraz z obliczoną niepewnością tej wartości. Oznacza to, że istnieją różnice między materiałami referencyjnymi a certyfikowanymi materiałami referencyjnymi pod względem identyfikowalności i niepewności. W codziennej pracy laboratorium zazwyczaj wykorzystywane są materiały referencyjne. Jeśli materiał referencyjny musi być prześledzony wstecz, certyfikowany materiał referencyjny z jego identyfikowalnością metrologiczną może być użyty jako odniesienie. Jednak certyfikowane materiały referencyjne istnieją obecnie tylko dla kilku mikotoksyn.

7. Jak czytać certyfikat?

Kwalifikowany certyfikat zawiera niezbędne informacje na temat materiału referencyjnego. Zazwyczaj zawiera on opis produktu wraz z numerem partii i datą ważności, dostawcę wraz z adresem, informację o zagrożeniach, przeznaczenie, instrukcje dotyczące prawidłowego stosowania, warunki przechowywania oraz, co najważniejsze, wartość referencyjną.

Data ważności dotyczy nieotwartego produktu w określonych warunkach przechowywania. W przypadku certyfikowanych materiałów referencyjnych certyfikat dokumentuje kilka innych cech: certyfikowaną wartość, budżet niepewności i omówienie identyfikowalności metrologicznej. Niepewność jest obliczana na podstawie takich czynników, jak czystość i przygotowanie produktu oraz - jeśli nie jest to nieistotne - jego stabilność i jednorodność (więcej informacji na temat obliczania i stosowania wartości niepewności można znaleźć w artykule "Niektóre niepewności"). Certyfikowana wartość jest potwierdzana przez analizę, w której kalibracja jest przeprowadzana względem niezależnie przygotowanej partii referencyjnej docelowego analitu.

1 WE nr 1881/2006.