Wyzwania w testowaniu alergenów - Spiking i odzyskiwanie danych

Kiedy zacząłem opracowywać testy immunologiczne do wykrywania alergenów w żywności, pierwszą rzeczą, która mnie uderzyła, był szeroki zakres różnych rodzajów żywności lub matryc, z którymi testy musiały pracować. Wywodząc się z branży medycznych testów immunologicznych, miałem do czynienia z ograniczoną liczbą różnych matryc. W moim przypadku była to surowica krwi. W przypadku żywności istnieje niemal nieskończona liczba różnych rodzajów próbek, z których każda ma swoje specyficzne właściwości.

Jak wybrać odpowiedni zestaw testowy?

Jak więc upewnić się, że wyprodukowany zestaw testowy jest odpowiedni do stosowania z tak różnorodnymi i wymagającymi próbkami? W tym miejscu następuje walidacja próbki. Proces ten polega na dodaniu znanej ilości interesującego nas alergenu do naszej matrycy (spike), a następnie próbie odzyskania tego alergenu (recovery). Ważną rzeczą do zapamiętania jest to, że jak sama nazwa wskazuje, testy immunologiczne wykorzystują składniki biologiczne (przeciwciała) do wykrywania interesujących nas białek alergennych. Podobnie jak w przypadku wszystkich systemów biologicznych, zestawy są wrażliwe na skrajności. W przypadku żywności, zestawy mogą nie działać tak, jak powinny w obecności silnych kwasów lub zasad, wysokiej zawartości soli, wysokiej zawartości tłuszczu itp. Wielu z tych skrajności można przeciwdziałać podczas procesu ekstrakcji. Zestawy wykorzystują zatem buforowany system, aby poradzić sobie ze zmianami pH, a dodanie buforu do próbki pomaga zmniejszyć i rozcieńczyć niektóre z innych problemów, takich jak sól i tłuszcz.

Czy mój odzysk jest akceptowalny?

Jeśli chodzi o odzysk znanej ilości alergenu z matrycy próbki, co uważa się za akceptowalne? Zanim odpowiemy na to pytanie, musimy określić, od czego zaczynamy. Czy jest to próbka pobrana, czy pobrana?

Próbki powstałe definiuje się jako próbki, w których znana ilość alergenu spożywczego została włączona podczas przetwarzania, naśladując jak najdokładniej rzeczywiste warunki, w których matryca próbki byłaby normalnie wytwarzana.

Temat poniesionych próbek zostanie omówiony bardziej szczegółowo w kolejnym wydaniu Spot On. W tym artykule skoncentruję się na nakreśleniu bardziej przystępnej metody wprowadzania znanej ilości alergenu do matrycy otrzymanej od dostawcy lub producenta i pomiaru jego odzysku.

W odniesieniu do odzysku, wytyczne stwierdzają, że:

"Idealne procentowe poziomy odzysku wahałyby się od 80 do 120%. Poziomy odzysku zależą zarówno od skuteczności etapu ekstrakcji, jak i procedury ELISA.

"W przypadku metod ELISA dla alergenów pokarmowych, ten poziom odzysku nie zawsze jest możliwy, szczególnie gdy analizowane są pewne trudne matryce. Ponadto, odzysk z pobranych próbek może znacznie różnić się od tych uzyskanych przy użyciu próbek wzbogaconych.

"Z tego powodu odzyski między 50 a 150% będą uważane za akceptowalne, o ile można wykazać, że są spójne".

Wytyczne zostały opublikowane w 2010 roku przez Association of Analytical Communities (AOAC) ze szczególnym uwzględnieniem ilościowych metod ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Wiele kluczowych punktów ma również zastosowanie do jakościowych lub półilościowych metod LFD (Lateral Flow Device).

"Nauka" stojąca za spikingiem

Kiedy otrzymujemy lub napotykamy nowy rodzaj żywności, który nie był wcześniej testowany, przeprowadzamy walidację odzysku kolców, aby upewnić się, że działa on tak, jak powinien z naszymi zestawami testowymi. Wykonamy próbkę na trzech różnych poziomach alergenu - niskim, średnim i wysokim - aby pokryć zakres wykrywania testu.

Niski pik alergenu będzie zbliżony do dolnej granicy oznaczalności, LLOQ, testu ELISA (w tym przypadku najniższa wartość kalibratora powyżej 0 ppm) lub zbliżony do granicy wykrywalności, LOD, urządzenia z przepływem bocznym. Średni pik będzie w środku krzywej kalibracji ELISA, a wysoki pik będzie na lub w pobliżu górnej granicy oznaczalności, ULOQ (najwyższa wartość kalibratora ppm). Próbka jest ekstrahowana i testowana zgodnie z ulotką dołączoną do zestawu.

Na przykład, jeśli dodamy 5 ppm migdałów do czekolady, spodziewamy się odzysku od 4 ppm do 6 ppm. Jeśli wynik nie mieści się w tym zakresie, istnieją kroki, które można podjąć, aby poprawić odzysk. Z doświadczenia wynika, że czekolada jest jedną z najtrudniejszych do testowania matryc spożywczych - jest pełna garbników i innych polifenoli, które mogą wiązać się z każdym alergennym białkiem, które może być obecne i tworzyć nierozpuszczalne kompleksy, które są trudne do ekstrakcji.

Takie trudności można przezwyciężyć, dodając dodatkowe białko do buforu ekstrakcyjnego. Nadmiar białka wiąże się z polifenolami i sprawia, że alergeny są dostępne do ekstrakcji. Moim białkiem z wyboru jest żelatyna rybna, chociaż można użyć innego materiału, takiego jak mleko w proszku, aby poprawić wydajność ekstrakcji z żywności o wysokiej zawartości polifenoli. W przypadku stosowania mleka w proszku należy uważać, aby nie zanieczyścić przestrzeni laboratoryjnej, zwłaszcza jeśli przeprowadzają Państwo testy na alergeny mleka.

Urządzenia przepływu bocznego, paski lub bagnety, jak się je czasami określa, mogą być walidowane pod kątem odzyskiwania kolców w podobny sposób jak zestaw testowy ELISA dla alergenów. Rzeczą, o której należy pamiętać przy wyborze wysokiego poziomu spike jest to, że chociaż LFD są w stanie wykryć bardzo wysokie poziomy ppm, można faktycznie przeciążyć urządzenie, dodając zbyt dużo alergenu. Może to wystąpić w ilościach większych niż 1% alergennej żywności.

Utrzymanie jakości i precyzji testu

Może być konieczne, aby producent zestawu ściśle współpracował z klientami, którzy rutynowo testują trudne matryce żywności. Ważne jest, aby zweryfikować, czy zestaw działa tak, jak powinien i ku zadowoleniu klienta. Można to osiągnąć, jak opisano powyżej, przeprowadzając eksperymenty odzyskiwania alergenów w problematycznej matrycy.

W niektórych przypadkach może być pożądane zmodyfikowanie lub zmiana standardowej metody zestawu, aby spełnić wymagania próbki i/lub klienta; powinno to być zawsze podejmowane zgodnie z wytycznymi producenta zestawu, aby zapewnić jakość i powtarzalność zestawu testowego.