Tworzenie płynnych kalibratorów mikotoksyn: Spojrzenie zza kulis

Materiały referencyjne lub kalibratory opisują substancje lub obiekty o jednej lub większej liczbie zdefiniowanych charakterystycznych wartości właściwości, które są używane jako miara lub punkt odniesienia dla metod pomiarowych. Biorąc pod uwagę znaczenie bezpieczeństwa konsumentów dla przemysłu spożywczego i paszowego, badanie mikotoksyn wymaga użycia materiałów referencyjnych w celu uzyskania dokładnych i wiarygodnych wyników.

Zawsze obecne zagrożenie

Mikotoksyny to naturalnie występujące wtórne metabolity grzybów toksyczne dla zwierząt i ludzi. Grzyby pleśniowe rozwijają się na polu i podczas przechowywania. Występujące w prawie wszystkich produktach rolnych na całym świecie, zidentyfikowano ponad 380 mikotoksyn, a toksyczność każdej substancji jest bardzo zróżnicowana. Z góry określone maksymalne dopuszczalne stężenia różnych mikotoksyn w surowcach roślinnych, takich jak ziarno, pszenica, kukurydza - by wymienić tylko kilka - zmusiły producentów towarów do dokładnego zbadania swoich próbek w laboratorium analitycznym, aby mieć pewność co do jakości swoich produktów.

Przygotowanie grawimetryczne

Często grzyb, który rośnie w optymalnych warunkach - wystarczająco ciepłej temperaturze, wysokiej wilgotności i odpowiednim podłożu - może wytwarzać mikotoksyny. W laboratorium historia materiału referencyjnego rozpoczyna się od próby dostosowania sztucznych warunków wzrostu w celu uzyskania optymalnej wydajności mikotoksyn. Obejmuje to zastosowanie odpowiedniego rodzaju grzybów - ponieważ każdy grzyb wytwarza swój własny charakterystyczny wzór metabolitów, których liczba może sięgać kilkuset. Utrzymanie szczepów grzybów do produkcji ma kluczowe znaczenie. Ich żywotność i funkcjonalność są stale monitorowane, ponieważ stanowi to podstawę wszystkich działań związanych z procesami produkcji materiałów referencyjnych. Grzyby pleśniowe to żywe organizmy, które z czasem mogą mutować, a nawet ulegać degeneracji, co prowadzi do zmniejszenia wydajności mikotoksyn. Po pewnym okresie przechowywania mogą powstawać nowe metabolity, co również może mieć ogromny wpływ na proces izolacji. Szczepy muszą być regularnie odnawiane w celu przeciwdziałania mutacjom, zanieczyszczeniom lub innym niepożądanym cechom.

Pierwszy etap, fermentacja, polega na stworzeniu środowiska laboratoryjnego tak smacznego, jak to tylko możliwe dla grzyba, aby promować jego wzrost. Optymalne pożywki również różnią się w zależności od szczepu, więc składniki takie jak sole i minerały są dostarczane jako źródło składników odżywczych. Pleśń może rosnąć przez pewien czas - od kilku dni do kilku tygodni - w tym czasie grzyb metabolizuje swoją pożywkę.

Po zakończeniu fermentacji i starannej kontroli procesu mikotoksyna jest ekstrahowana z materiału hodowlanego przy użyciu odpowiedniego rozpuszczalnika organicznego. W zależności od struktury molekularnej, mogą to być polarne lub niepolarne rozpuszczalniki organiczne. Podczas fermentacji pleśnie wytwarzają głównie zanieczyszczenia oprócz toksyny będącej przedmiotem zainteresowania, np. inne metabolity, barwniki, oleje itp.

Otrzymany surowy ekstrakt często zawiera wiele zanieczyszczeń. Podczas izolacji lub oczyszczania mikotoksyna jest krok po kroku zbliżana do docelowej czystości >98% poprzez różne zastosowania chromatograficzne i preparatywne o różnej selektywności. Niektóre toksyny mają korzystne struktury molekularne i mogą być krystalizowane z przesyconego roztworu polarnych lub apolarnych rozpuszczalników organicznych. Dzieje się tak na przykład poprzez schłodzenie roztworu, odparowanie rozpuszczalnika krystalizacyjnego lub zmieszanie kilku rozpuszczalników o różnej polarności. Inne toksyny można otrzymać w postaci krystalicznej, sproszkowanej poprzez liofilizację. Poprzez krystalizację czystość toksyny jest ponownie zwiększana, aż do uzyskania docelowej czystości.

Kontrola jakości

HPLC, fotometr UV i HPLC-MS są wykorzystywane do określenia/potwierdzenia czystości wyprodukowanego surowca. W zależności od toksyny, można to zrobić na przykład za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z detekcją diodową, detekcją fluorescencyjną lub podobną, z fotometrem UV (analiza jakościowa i ilościowa związku) lub za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z detekcją spektrometrii mas. Spektrometria masowa jest szczególnie wymagana do opisanego powyżej określenia czystości izotopowej (np. > 98% atomów 13C) mikotoksyn znakowanych izotopem 13C. Materiały referencyjne mikotoksyn mają niszową pozycję na rynku. Dlatego czasami trudno jest znaleźć substancje porównawcze, które są dostępne na rynku i mogą być wykorzystywane do kontroli procesu podczas produkcji i kontroli jakości.

Dostawa

Po przejściu końcowej kontroli jakości, stała mikotoksyna jest upłynniana w celu wykorzystania jako płynny materiał referencyjny mikotoksyny. Płynny roztwór kalibratora jest następnie butelkowany i tworzony jest certyfikat analizy, określający wartość właściwości i jej niepewność, który towarzyszy każdemu pojedynczemu kalibratorowi.