Testowanie GMO: 4 ważne pytania

Czy badają Państwo białko czy DNA? Czym różnią się metody badania surowców od metod badania materiałów przetworzonych? To tylko dwie kwestie, o których musi pamiętać każdy, kto chce przeprowadzić testy na obecność GMO. Menedżer produktu Christina Huber oferuje kilka praktycznych odpowiedzi.

Jak wspomniano w poprzednim artykule, w różnych krajach obowiązują różne przepisy dotyczące zatwierdzania handlu genetycznie zmodyfikowanymi roślinami lub ich uprawy w ramach ich jurysdykcji. W związku z tym kryteria testowania różnią się znacznie w zależności od kraju. Niniejszy artykuł przedstawia kilka podstawowych kwestii przy wyborze odpowiedniego formatu testu w celu ustalenia, czy próbka pochodzi z genetycznie zmodyfikowanej rośliny. Modyfikacja genetyczna odnosi się do każdej sztucznej zmiany DNA w roślinie, poprzez edycję genomu lub wstawienie obcych fragmentów DNA. Zmodyfikowany gen przekazuje nową cechę, taką jak odporność na owady, odporność na herbicydy lub inne cechy istotne dla rolnictwa. Jednym z pierwszych pytań, z jakimi się Państwo spotkają, jest to, czy chcą Państwo testować DNA czy białko. Uzupełniając tę decyzję, należy zdecydować, czy badany będzie surowiec, czy materiał przetworzony. Trzecią kwestią jest Państwa cel: czy szukają Państwo konkretnej cechy GMO, czy po prostu chcą Państwo wiedzieć, czy Państwa uprawa jest wolna od GMO? Wreszcie, czynniki takie jak czułość, szybkość i łatwość użycia również odgrywają dużą rolę. Wszystkie te decyzje pomogą Państwu w wyborze odpowiedniego formatu spośród najczęściej stosowanych opcji testowania: reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), test immunoenzymatyczny (ELISA) lub urządzenia do przepływu bocznego (LFD).

1) DNA czy białko?

Gdy roślina jest modyfikowana, jej sekwencja DNA ulega zmianie. Zmianę można określić poprzez identyfikację sztucznej zmiany samego DNA lub poprzez wykrycie wyrażonego białka, które nie występuje naturalnie w danej uprawie. Metody testowania oparte na kwasach nukleinowych, takie jak PCR, amplifikują interesujący region genomu rośliny w celu uzyskania miliardów kopii małych fragmentów DNA przy użyciu tak zwanych starterów i polimerazy DNA jako enzymu. Wcześniej te fragmenty DNA można było rozdzielić i wizualizować na żelu agarozowym, ale obecnie bardziej wyrafinowane instrumenty pozwalają na bezpośredni pomiar reakcji amplifikacji w oparciu o techniki fluorescencyjne. Metoda PCR jest nie tylko jakościowa, ale pozwala również na ilościowe oznaczenie materiału genetycznie zmodyfikowanego w próbce. Do wykrywania białek stosuje się testy immunologiczne. Te testy immunologiczne wykorzystują specyficzne przeciwciała, które mogą wiązać białko. Dostępne są dwa różne formaty testów - urządzenie z przepływem bocznym (LFD) i test immunoenzymatyczny (ELISA). Oba systemy działają w formacie kanapkowym, co oznacza, że jedno przeciwciało jest unieruchomione na powierzchni, która specyficznie wiąże interesujące białko. Gdy białko zwiąże się z unieruchomionym przeciwciałem, znakowane przeciwciało drugorzędowe może się związać, tworząc w ten sposób kanapkę i dając kolorowy sygnał. Jeśli interesujące nas białko nie jest dostępne, nie można utworzyć kanapki, a zatem kolor nie będzie widoczny, wskazując, że badana roślina jest wolna od GMO. W większości przypadków test ELISA wykorzystuje 96-dołkową płytkę pokrytą specyficznym przeciwciałem, która umożliwia jednoczesną analizę wielu próbek. LFD to paski, które mają linię testową i kontrolną pokrytą specyficznym przeciwciałem w celu wychwycenia białka będącego przedmiotem zainteresowania. Jeśli pojawi się linia testowa, wynik jest pozytywny, wskazując na obecność białka docelowego. Testy te występują w formacie ilościowym lub jakościowym; do ilościowego określenia wyniku wymagany jest czytnik LFD. Podsumowując, testy DNA odczytują zmienioną sekwencję DNA, podczas gdy testy białkowe identyfikują nowe białko pochodzące z tej określonej sekwencji DNA. Specyficzne cechy analizowanej próbki również odgrywają rolę w określeniu, czy metoda oparta na DNA lub białku najlepiej odpowiada Państwa potrzebom. W dalszej części przyjrzymy się różnym wymaganiom dotyczącym testowania surowców i materiałów przetworzonych.

2) Czym różni się badanie surowców od badania materiałów przetworzonych?

Jeśli chodzi o określenie odpowiedniej techniki testowania, pojawia się kolejne pytanie wykraczające poza cel (DNA lub białko): czy matryca składa się z surowego czy przetworzonego materiału? Jest to szczególnie istotne w przypadku testowania białek. Surowce wyrażają nienaruszone białko, co oznacza, że można stosować zarówno testy PCR, jak i immunologiczne. Jednak po przetworzeniu surowca jego białka denaturują, w wyniku czego zmieniają swoją naturalną strukturę i w większości przypadków nie można ich wykryć za pomocą testów immunologicznych. Na przykład obróbka cieplna jest procesem, który może prowadzić do denaturacji białek. Jednak proces ten nie zmienia sekwencji DNA; dlatego PCR może być użyty do wykrycia wprowadzonego genu nawet w niektórych przetworzonych materiałach. Więcej opcji testowania jest dostępnych, jeśli próbka jest surowcem: zarówno metody oparte na DNA, jak i białkach wykryją modyfikację genetyczną. Jeśli jednak próbka jest mocno przetworzonym materiałem, w którym białko mogło ulec denaturacji, opcje są ograniczone do testów DNA.

3) Czy w mojej próbce występuje określona cecha? Czy jest ona wolna od GMO? Co dokładnie muszą Państwo wiedzieć?

Czasami konieczne jest zbadanie próbki pod kątem określonych cech w celu ustalenia, czy zawiera ona rośliny niedozwolone w niektórych regionach. Może być również konieczne ustalenie, czy próbka jest całkowicie wolna od GMO, niezależnie od jakiejkolwiek konkretnej cechy. Aby przeprowadzić test na obecność określonego GMO, ważne jest, aby wiedzieć, które białka ulegają ekspresji w interesującym nas GMO. Informacje te można uzyskać od producenta lub ze źródeł takich jak strona internetowa ISAAA (http://www.isaaa.org/), gdzie wymienione są wszystkie zatwierdzone GMO. Następnym krokiem jest określenie pożądanego formatu testu (PCR, ELISA lub LFD) w oparciu o pożądaną specyficzność, czas uzyskania wyniku, rodzaj materiału i dostępny sprzęt laboratoryjny. Analitycy muszą być tutaj ostrożni, ponieważ istnieje wiele produktów GMO, które zawierają nie tylko jeden wstawiony gen, ale kilka (zwanych zdarzeniami stacked); dlatego też, jeśli chcesz przetestować określone GMO, musisz przetestować wszystkie wstawione geny (lub wyrażone białka) związane z tą konkretną rośliną. Inną strategią testowania GMO jest ustalenie, czy roślina w ogóle zawiera jakiekolwiek materiały GMO. Ten rodzaj badania nie jest specyficzny dla żadnego konkretnego zdarzenia. Aby wykryć, czy próbka jest całkowicie wolna od GMO, wystarczy przetestować tylko jedno zdarzenie w każdej uprawie; jest to skuteczne nawet w przypadku upraw GMO z połączonymi zdarzeniami, ponieważ udowodnienie obecności tylko jednego zdarzenia jest wystarczające, aby udowodnić obecność GMO. Wszystkie trzy techniki są odpowiednie dla tego rodzaju testu. PCR zapewniłby najszerszy zakres, ponieważ na przykład bardzo często wstawiany jest NOS-terminator lub promotor 35S. Podczas testowania za pomocą pasków LFD, pasek kombinowany może wykryć kilka białek jednocześnie. Te dwa podejścia zależą wyłącznie od potrzeb klienta, ponieważ dla niektórych może być ważniejsze, czy uprawa jest wolna od GMO (jak w kraju, w którym uprawa jest zabroniona, ale mogą wystąpić nielegalne nasadzenia). Inni mogą chcieć wiedzieć konkretnie, jaką roślinę zasadzili.

4) Jak wybrać właściwą metodę testowania, biorąc pod uwagę inne czynniki, takie jak środowisko testowe?

Innym czynnikiem, który odgrywa rolę w wyborze odpowiedniego formatu testowania, jest środowisko testowe. Czy mają Państwo do dyspozycji laboratorium i przeszkolony personel, czy też wolą Państwo przeprowadzić szybki test, który nie wymaga żadnego sprzętu laboratoryjnego? Tabela 1 podsumowuje dostępne formaty testów oraz ich zalety i wady. Proszę przeanalizować tabelę krok po kroku. Jako metoda referencyjna dla testów GMO, PCR jest najbardziej odpowiednią metodą, jeśli chcą Państwo przetestować jakikolwiek przetworzony materiał. Technika ta zapewnia również najwyższy stopień czułości i wykrywa praktycznie każde GMO. Jednak jej istotną wadą jest to, że potrzebny jest sprzęt laboratoryjny i przeszkolony personel. Aby przeprowadzić PCR, zwłaszcza gdy pożądana jest kwantyfikacja, niezbędne są dokładne umiejętności pipetowania, ponieważ nieprecyzyjne pipetowanie może prowadzić do błędnych lub niejednoznacznych wyników. Główną zaletą testu ELISA jest możliwość jednoczesnego testowania wielu próbek. Jest to ważne, gdy chcą Państwo przeprowadzić testy pojedynczych nasion. Ponieważ jednak jest to test oparty na białkach, może być stosowany tylko do surowców. Jeśli porównają Państwo wszystkie trzy techniki pod względem czasu oczekiwania na wynik, LFD jest najszybszą metodą. Paski LFD mogą być używane na miejscu i nie wymagają zaawansowanego oprzyrządowania. Tak więc, jeśli chcą Państwo przetestować przychodzącą przesyłkę i potrzebują szybkich wyników, bardzo rozsądne byłoby wybranie testu LFD, ponieważ wyniki są dostępne w ciągu 10 minut; nie jest potrzebny personel laboratoryjny ani niewielki sprzęt. Technika ta nie wymaga również żadnych umiejętności laboratoryjnych, ponieważ procedura została zaprojektowana tak, aby była łatwa w użyciu. Która metoda jest zatem najlepsza? Państwa decyzja jest ostatecznie funkcją pożądanego czasu uzyskania wyniku oraz obiektów, sprzętu i personelu, którymi Państwo dysponują.