Nie zwykli podejrzani: 5 luk w Państwa programie monitorowania środowiska

Nawet najlepiej zaplanowane programy monitorowania czyszczenia i dezynfekcji mają swoje martwe punkty. Stefan Widmann przygląda się bliżej pięciu najbardziej prawdopodobnym - i najbardziej niebezpiecznym - lukom w Państwa programie monitorowania środowiska i wyjaśnia, czym one są, dlaczego należy się nimi przejmować i co można z tym zrobić.

#1 Mikroorganizmy zdolne do życia, ale niekulturowalne (VBNC)

Przez długi czas mikrobiolodzy zakładali, że wszelkie bakterie, które nie wyrosły na normalnych pożywkach, były martwe. Późniejsze badania ujawniły, że istnieje trzeci stan poza kulturą i śmiercią: żywotny, ale niehodowalny (VBNC).

Ogólnie rzecz biorąc, bakterie w stanie VBNC nie rozmnażają się, ale nadal żyją, o czym świadczy ich aktywność metaboliczna. Najistotniejszy dla nas jest fakt, że mogą one stać się zdolne do hodowli po resuscytacji, a tym samym rozmnażać się w żywności. Co więcej, niektóre bakterie chorobotwórcze nie rozwijają się pod nieobecność żywiciela i muszą jedynie przetrwać w żywności do momentu spożycia, aby wywołać chorobę.

Istnieje wiele powodów, dla których bakterie mogą przejść w stan VBNC; głodzenie, inkubacja poza zakresem temperatur optymalnym dla wzrostu, podwyższone stężenia osmotyczne, poziomy stężenia tlenu lub ekspozycja na białe światło to tylko niektóre z nich. Specyficzne cechy danego szczepu bakterii określają, co dokładnie powoduje, że bakterie wchodzą w ten stan.

Dlaczego powinno to Państwa obchodzić? Niektóre bakterie zdolne do wejścia w stan VBNC stanowią zagrożenie dla produkcji żywności. Chociaż nie znamy jeszcze wszystkich gatunków bakterii, które mogą stać się VBNC, znamy niektóre, które to robią; zaliczają się do nich organizmy wskaźnikowe (takie jak Klebsiella aerogenes i Klebsiella pneumoniae), zafałszowania (takie jak Lactobacillus plantarum i Lactococcus lactis) i patogeny (takie jak Salmonella Typhimurium, Campylobacter coli lub Listeria monocytogenes).

Po ich zidentyfikowaniu musimy teraz zapytać, czy bakterie te mogą powrócić do stanu w pełni nadającego się do hodowli i potencjalnie patogennego. Mikrobiolodzy przez długi czas nie mieli odpowiedzi na to pytanie, ponieważ trudno jest w pełni oddzielić bakterie VBNC od tych, które można hodować. Naukowcy rozwiązali ten problem, częściowo stosując podejście statystyczne: rozcieńczają dużą liczbę bakterii VBNC do punktu, w którym jest prawie niemożliwe, aby pozostały jakiekolwiek bakterie zdolne do hodowli. Bakterie są następnie liczone po określonym czasie. Jeśli zaobserwuje się wysoki stopień wzrostu, jedynym możliwym wnioskiem jest to, że bakterie opuściły stan VBNC i stały się zdolne do hodowli.

Kolejnym wnioskiem jest to, że jeśli mogą one powrócić do stanu hodowlanego, mogą również ponownie stać się patogenne. Istnieją przykłady dokładnie tego zjawiska prowadzącego do wybuchu epidemii. Na przykład, VBNC E. coli O157 były podejrzewane w wybuchu epidemii w Japonii w 1997 roku, ponieważ całkowita liczba E. coli była nieznaczna, a szczepy shigatoksynotwórcze, takie jak O157, mogły powodować choroby w bardzo małych ilościach.

#2 Bakterie beztlenowe i mikroaerofilne

Bakterie beztlenowe lub, bardziej ogólnie, mikroorganizmy beztlenowe można podzielić na trzy grupy: obligatoryjne, aero-tolerancyjne i fakultatywne. Jak wskazują ich nazwy, każda z nich ma specjalne wymagania dotyczące otaczającego je powietrza, a dokładniej tlenu. Beztlenowce obligatoryjne, takie jak Clostridioides difficile, są uszkadzane przez tlen i umierają wkrótce po ekspozycji. Bakterie tolerujące tlen, takie jak Clostridium botulinum, nie mogą z niego korzystać i nie umierają ani nie rosną w jego obecności. Beztlenowce fakultatywne mogą wykorzystywać tlen, ale nie potrzebują go do wzrostu, jak w przypadku E. coli. Istnieje również grupa bakterii mikroaerofilnych, takich jak Campylobacter, które potrzebują tlenu do wzrostu, choć w znacznie mniejszych ilościach (1-2%) niż w normalnym powietrzu, ale mogą być hamowane w warunkach tlenowych.

Dlaczego powinno to Państwa obchodzić? Kilka patogennych bakterii ma te specjalne wymagania dotyczące wzrostu. Obecnie termotolerancyjne gatunki Campylobacter są powodem do niepokoju wśród pracowników służby zdrowia. Średnio co drugi kurczak jest zakażony bakterią Campylobacter, co sprawia, że mięso drobiowe jest jedną z najczęstszych przyczyn zatruć pokarmowych. W UE choroby wywołane przez bakterie z rodzaju Campylobacter występują dwa razy częściej niż te spowodowane przez Salmonellę. Z grupy beztlenowców, gatunek Clostridia, taki jak C. botulinum, jest odpowiedzialny za chorobę przenoszoną przez żywność znaną jako zatrucie jadem kiełbasianym, często przenoszoną przez żywność w puszkach (tj. ubogą w tlen), w której C. botulinum może się rozwijać i wytwarzać związek botulinowy, który jest toksyczny dla ludzi. Inny gatunek Clostridia, C. perfringens, jest najczęstszym źródłem zatruć pokarmowych w USA i Kanadzie i powoduje objawy, takie jak skurcze brzucha i biegunka. Ryzyko zakażenia C. perfringens jest szczególnie silnie skorelowane z żywnością trzymaną lub przechowywaną w ciepłych warunkach przez dłuższy czas, co sprzyja ich wzrostowi do liczby zakaźnej (104 jtk/g).

#3 Anomalia Wielkiej Liczby Płytek

Niektóre szacunki wskazują, że tylko 1% bakterii może być hodowanych przy użyciu wiedzy i technik, którymi obecnie dysponujemy. "Anomalia wielkiej liczby płytek" to termin, którego używamy do opisania obserwacji, że mikroskopijne liczby komórek są znacznie wyższe niż odpowiadające im liczby "jednostek tworzących kolonie" na płytkach agarowych. Kilka przykładów może najlepiej zilustrować to zjawisko: podczas gdy 50% mikroorganizmów flory jamy ustnej można hodować na płytkach agarowych, większości flory żołądkowo-jelitowej nie można w ogóle hodować. Przyczyny tego są liczne, ale społeczność organizmów otaczających dany gatunek, w tym inne bakterie, a także rośliny i zwierzęta, może odgrywać ważną rolę.

Metody liczenia płytek tlenowych opierają się na bardzo ogólnych pożywkach, które nie wspierają wzrostu większości grup bakterii. Technicznie rzecz biorąc, nie jest to tak naprawdę część wielkiej anomalii liczby płytek, ponieważ niektóre bakterie są w stanie rosnąć na specjalnych płytkach agarowych w specjalnych warunkach (takich jak warunki beztlenowe lub mikroaerofilne).

Dlaczego powinno to Państwa obchodzić? Duża anomalia liczby płytek nie stwarza znaczących problemów w codziennych testach, ponieważ liczba płytek tlenowych dla mikroorganizmów wskaźnikowych jest specyficzna dla danego środowiska produkcyjnego i jako taka zawsze odnosi się do ustalonego poziomu bazowego określonego dla tego środowiska produkcyjnego. Metody płytkowe są jednak bardzo czasochłonne, wymagając okresu inkubacji do trzech dni, w zależności od obowiązującego protokołu. Istnieją metody bezpośrednie, które nie wymagają etapu hodowli w celu zliczenia bakterii; mikroskopy zapewniają kompleksowy obraz bakterii, ale są również bardzo czasochłonne. Podczas gdy metody bezpośrednie, takie jak cytometria przepływowa, są powszechne w zakładach uzdatniania wody, nie są one powszechne w przemyśle spożywczym.

#4 Bakterie psychrotrofowe

Bakterie psychrotrofowe mogą rosnąć w temperaturach tak niskich jak 0 °C, przy optymalnych i maksymalnych temperaturach wzrostu powyżej 15 °C. Sprawia to, że takie drobnoustroje są szczególnie problematyczne w przypadku produktów spożywczych i napojów, takich jak surowe mięso i mleko przechowywane w niskich temperaturach przez dłuższy czas. Psychrotroficzne grupy bakterii najczęściej występujące w żywności to Gram-ujemne rodzaje Pseudomonas, Aeromonas, Achromobacter, Serratia, Alcaligenes, Chromobacterium i Flavobacterium, a także Gram-dodatnie rodzaje, takie jak Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptococcus, Lactobacillus i Microbacteria. Wiadomo również, że Listeria monocytogenes i niektóre szczepy Clostridium botulinum są zdolne do namnażania się w temperaturach chłodniczych.

Dlaczego powinno to Państwa obchodzić? Bakterie psychrotrofowe są substancjami zafałszowującymi i mogą znacząco obniżyć jakość i okres przydatności do spożycia żywności. Schłodzone zakłady produkcyjne i zbiorniki magazynowe oferują korzystne środowisko do namnażania się tych gatunków bakterii. Na przykład w schłodzonym mleku Pseudomonas fluorescens może wytwarzać zarówno proteazy, jak i lipazy. Dlatego też gatunki należące do rodzaju Pseudomonas są uważane za zwykle odpowiedzialne za trudności technologiczne, ponieważ wytwarzane przez nie proteazy i lipazy mogą powodować degradację tłuszczu i białek mleka, nadając mleku szarawy kolor i gorzki smak. Gatunki Pseudomonas są mikroorganizmami najczęściej odpowiedzialnymi za psucie się mięsa przechowywanego w warunkach tlenowych. Powszechnie wiadomo, że gatunki Pseudomonas są bardzo odporne i zdolne do wytrzymania stresujących warunków środowiskowych, które hamowałyby wzrost innych mikroorganizmów powodujących psucie. W pakowanym próżniowo, chłodzonym surowym mięsie, mikroflora jest zdominowana w większości przypadków przez psychrotroficzne bakterie kwasu mlekowego. Co więcej, rozwój patogenów podczas przechowywania w lodówce może prowadzić do poważnych chorób.

#5 Biofilmy

Mikroorganizmy są w stanie kolonizować powierzchnie, tworząc polimerową matrycę, w której może występować wiele gatunków drobnoustrojów; jest to znane jako biofilm. Dowody wskazują, że zdolność do tworzenia i przetrwania w biofilmach nie jest ograniczona do określonych grup mikroorganizmów. W rzeczywistości zdecydowana większość bakterii jest w stanie tworzyć biofilmy. Biofilmy mogą zatem składać się z monokultur lub kilku różnych gatunków mikroorganizmów. Niektórzy badacze sugerują, że złożona struktura mieszanych biofilmów czyni je bardziej stabilnymi i odpornymi na chemikalia czyszczące. Początkowa populacja, która wiąże się z powierzchnią, może zmienić właściwości tej powierzchni, umożliwiając tym, którzy pojawią się później, przyleganie poprzez połączenie między komórkami; w niektórych przypadkach przyłączenie drugiego gatunku może zwiększyć stabilność populacji biofilmu. Na przykład badania pokazują, że L. monocytogenes jest bardziej skłonny do przylegania do stali w obecności Pseudomonas.

Dlaczego powinno to Państwa obchodzić? Biofilmy, które tworzą się na sprzęcie do przetwarzania żywności i innych powierzchniach mających kontakt z żywnością, stanowią trwałe źródło zanieczyszczenia, zagrażając ogólnej jakości i bezpieczeństwu produktów spożywczych i mogą powodować choroby przenoszone przez żywność, a także straty ekonomiczne. Wiadomo, że mikroorganizmy powodujące psucie się żywności są odpowiedzialne za prawie jedną trzecią strat w łańcuchach dostaw żywności, co sprawia, że zapobieganie biofilmom i ich kontrola są priorytetem w przemyśle spożywczym. Mikroorganizmy tworzące lub rozwijające się w biofilmach są bardziej odporne na dezynfekcję, co czyni je problematycznymi w wielu gałęziach przemysłu spożywczego. Inne skutki biofilmów, takie jak korozja powierzchni metalowych, są kolejnym krytycznym problemem w przemyśle spożywczym. W każdym przypadku obecność biofilmów w fabryce żywności stanowi zagrożenie dla zdrowia ludzkiego. Stopień zagrożenia zależy od gatunków bakterii tworzących tę trójwymiarową, żywą strukturę.

Jak wypełnić te luki? Potencjał cytometrii przepływowej Producenci żywności zazwyczaj nie mają do dyspozycji wielu opcji. Te, które oferują odrobinę precyzji, takie jak barwienie witalne w połączeniu z mikroskopami, mogą określać ilościowo bakterie VBNC, ale są czasochłonne i wymagają specjalnego sprzętu. Wszystkie grupy bakterii beztlenowych i mikroaerofilnych - z wyjątkiem fakultatywnych beztlenowców - mogą rosnąć na klasycznych płytkach agarowych, ale tylko przy dokładnie kontrolowanym poziomie tlenu.

Płytki agarowe nie są jednak panaceum. Płytki agarowe są w stanie policzyć tylko około 1% znanych gatunków bakterii, a uzyskanie wyników zajmuje kilka dni - do 10 dni w przypadku bakterii psychrotrofowych. Metody ATP, choć szybkie, nie określają ilościowo bakterii i mają ograniczone zastosowanie w wykrywaniu bakterii z biofilmów; dane kinetyczne ze swobodnie zawieszonych komórek planktonicznych nie powinny być wykorzystywane jako odniesienie, ponieważ uwalnianie ATP jest znacznie niższe w przypadku biofilmów. Co więcej, ślady ATP pochodzące z resztek żywności lub grzybów mogą łatwo przyćmić ATP uwalniane przez bakterie, ponieważ komórki eukariotyczne zawierają 10 milionów razy więcej ATP niż komórki prokariotyczne. W związku z tym urządzenia ATP stosowane do wykrywania biofilmów mają zwykle znacznie wyższą granicę wykrywalności, co oznacza, że nie są tak czułe, jak w przypadku wykrywania swobodnie pływających bakterii.

Każdy z tych pięciu przypadków pokazał, jak trudne może być wykrywanie bakterii i pozostałości na powierzchniach produkcji żywności; niedociągnięcia najpopularniejszych metod wykrywania, takich jak płytkowanie i testy ATP, są tak uparte, jak dobrze udokumentowane.

Co mogą zrobić producenci żywności, aby wypełnić luki, które pozostawiają metody kulturowe i testy ATP? W następnym artykule mój kolega Cristian Ilea omawia potencjał impedancyjnej cytometrii przepływowej i cytometru przepływowego CytoQuant®, nowego rozwiązania, które natychmiast określa ilościowo bakterie i cząsteczki pozostałości na powierzchniach.