Zapobieganie fałszywie dodatnim wynikom testów na obecność patogenów

Fałszywie pozytywne wyniki w wykrywaniu patogenów, które są kosztowne i żmudne, można zminimalizować za pomocą fagów, które zmniejszają występowanie bakterii reagujących krzyżowo w testach patogenów. Bakterie reagujące krzyżowo mogą powodować fałszywie dodatnie wyniki i hamować wzrost danego patogenu.

Wyniki fałszywie dodatnie powodują dodatkowe koszty dla producentów żywności, oprócz dodatkowego czasu potrzebnego na potwierdzenie wyników. Zgodnie z normami ISO/FDA/USDA, proces potwierdzania wyników testu rozpoczyna się od posiewu selektywnych płytek agarowych z przypuszczalnie pozytywnej próbki. Te płytki agarowe muszą być inkubowane przez dwa dni, aby udowodnić, czy jest to prawdziwa próbka z wynikiem pozytywnym, i inkubowane w innej temperaturze niż próbki rutynowe. Jeśli laboratorium nie posiada dodatkowego inkubatora, główny inkubator musi zostać odstawiony na bok i dostosowany do wymaganej temperatury, co oznacza przestoje, ponieważ inkubator nie może być używany do wzbogacania. Kolejną wadą etapu potwierdzania jest to, że selektywne płytki agarowe kosztują. Ponieważ mają one bardzo ograniczony okres przydatności do spożycia, trudno jest przechowywać je w magazynie. Ogólnie rzecz biorąc, fałszywie pozytywne testy wymagają niepotrzebnego czasu i pieniędzy.

Problem wyników fałszywie dodatnich

Wyniki fałszywie dodatnie mogą wystąpić w przypadku każdej metody wykrywania patogenów. Nie ma znaczenia, czy jest to technologia oparta na DNA, biochemiczna czy immunologiczna. Wszystkie mają do czynienia z tą samą kwestią wyższej czułości w porównaniu z wyższą selektywnością. Dobrym podejściem jest wyeliminowanie bakterii reagujących krzyżowo przed wykryciem, w tym celu stosuje się antybiotyki. Jednak w większości zastosowań antybiotykom brakuje selektywności.

Przezwyciężenie wyzwania selektywności

Bakteriofagi (lub fagi) są najbardziej rozpowszechnionymi organizmami w naszym środowisku i są obecne w dużych ilościach w wodzie, żywności i różnych innych źródłach. Zostały odkryte przez kanadyjskiego biologa Félixa Huberta d'Hérelle'a w 1917 roku. Ich nazwa oznacza "zjadacze bakterii", co w pewnym stopniu określa ich działanie. Bakteriofagi mają wysoką specyficzność gospodarza, przyczepiając się do bakterii. Dużą zaletą stosowania fagów jest to, że są one nieszkodliwe dla ludzi, zwierząt i roślin. W rzeczywistości ludzie są rutynowo narażeni na działanie fagów poprzez spożywanie żywności lub wody bez żadnych negatywnych skutków. Fagi można nazwać "naturalnymi wrogami" bakterii, z którymi są związane. W przetworzonym mięsie i produktach mięsnych znajduje się około 108 fagów na gram. Duża liczba fagów jest również obecna w ludzkim przewodzie pokarmowym. Zanim antybiotyki stały się powszechnie dostępne, fagi były stosowane w leczeniu infekcji bakteryjnych.

Stosowane od dziesięcioleci

Tak zwana terapia fagowa została opracowana w USA i byłym ZSRR. Nawet gdy w świecie zachodnim opracowywano antybiotyki, były blok sowiecki kontynuował badania nad terapią fagową. W erze pozimnowojennej badania nad fagami były kontynuowane w Gruzji, gdzie są prowadzone do dziś. Fagi charakteryzują się bardzo wysoką specyficznością w stosunku do bakterii gospodarza, co stanowi potencjalnie interesujące zastosowanie w przemyśle spożywczym i paszowym, a także w przemyśle biotechnologicznym. Obecnie fagi są stosowane jako dodatki do eliminacji organizmów chorobotwórczych w żywności, jako narzędzie do wykrywania bakterii lub jako dodatek do systemu pożywek Romer Labs SELECT™, w celu zmniejszenia lub nawet wyeliminowania konkurencyjnej flory bakteryjnej, umożliwiając wzrost docelowych gatunków bakterii chorobotwórczych do wykrywalnego poziomu. Są one bardziej selektywne niż antybiotyki, a drobnoustroje nie rozwijają na nie oporności.

Identyfikacja bakterii reagujących krzyżowo

Aby zidentyfikować fagi, które mogą być wykorzystywane w selektywnych pożywkach wzbogacających lub innych zastosowaniach do hamowania lub nawet zabijania konkurencyjnych bakterii, kluczowe pytanie brzmi: Jak mogę w ogóle zacząć je znajdować? Najlepszym sposobem na rozpoczęcie jest przyjrzenie się próbkom żywności lub paszy, ponieważ te materiały testowe zawierają bakterie, które powinny zostać zahamowane podczas wzbogacania. Szczepy bakterii, które są daleko spokrewnione z poszukiwanym patogenem, nie są celem fagów, ale szczepy, które są blisko spokrewnione z docelowym patogenem, mogą powodować fałszywie dodatnie wyniki.

Transgeniczne? Wcale nie!

Po zidentyfikowaniu reagujących krzyżowo bakterii tła, następnym krokiem jest poszukiwanie faga, który może działać przeciwko nim. Fagi można znaleźć wszędzie, na przykład w surowych ściekach, wodach powierzchniowych, żywności i środowisku rolniczym. Najłatwiejszym sposobem ich ekstrakcji, jeśli jest to sprzedana matryca, jest odwirowanie. W ten sposób fagi pozostaną w supernatancie, podczas gdy inne składniki, takie jak bakterie, utworzą osad na dnie pojemnika. Supernatant zawiera heterogeniczną mieszaninę różnych fagów. Następnie różne fagi są izolowane i należy określić bakteryjnego gospodarza, którego infekują. Można to zrobić za pomocą tak zwanej techniki "soft agar overly" lub "simple spotting". W tej technice na tradycyjną płytkę agarową nakłada się trawnik bakteryjny, a supernatanty fagowe są nanoszone punktowo na trawnik bakteryjny. Po całonocnej inkubacji fagi tworzą płytki (lub strefy oczyszczania), które są widoczne gołym okiem. Płytki to strefy, w których fagi zabiły bakterie w wyniku reakcji litycznej. Teraz klony fagowe można wyizolować z agaru, co oznacza, że wszystkie są kopiami tego samego szczepu fagowego.

Jak pomagają fagi

Teraz nadszedł czas, aby znaleźć najlepsze fagi do zabijania bakterii reagujących krzyżowo w wzbogaceniach patogenów. Osiąga się to poprzez testowanie fagów przeciwko reagującym krzyżowo bakteriom, a także docelowemu patogenowi. Preferowany jest format mikromiareczkowy, aby zminimalizować koszty i przyspieszyć testy. Widoczna reakcja lityczna w studzience wskazuje, że fag jest skuteczny przeciwko bakteriom. Po kilku próbach laboratoryjnych można w końcu zidentyfikować odpowiednie fagi - są to fagi, które hamują wzrost blisko spokrewnionych szczepów bakterii, a jednocześnie nie wpływają na wzrost docelowego patogenu. Fagi te można następnie wykorzystać do wyeliminowania bakterii reagujących krzyżowo w systemach testowych do wykrywania patogenów, zmniejszając częstość występowania fałszywie dodatnich sygnałów w programie monitorowania patogenów, a tym samym oszczędzając dużo pieniędzy i czasu.