Technologie szybkiego testowania higieny środowiska: Bliższe spojrzenie

Powszechnie stosowane technologie badań środowiskowych dzielą się na dwa ogólne podejścia: badanie pozostałości i badanie mikroorganizmów. Poniżej przedstawiamy różne technologie w ramach każdego podejścia, sposób ich działania oraz ich zastosowanie i zalety.

Badanie pozostałości

Metody ATP

Trójfosforan adenozyny (ATP) jest nukleotydem wykorzystywanym w komórkach jako koenzym dostarczający energię. Można go traktować jako molekularną "jednostkę waluty" do przenoszenia energii we wszystkich żywych komórkach. Energia jest potrzebna do wszystkich czynności komórkowych, w tym syntezy białek i błon, ruchu komórek i podziału komórek. Energia jest przekazywana, gdy ATP rozpada się na difosforan adenozyny i monofosforan adenozyny. Hydroliza kowalencyjnych połączeń fosforanów uwalnia energię, która jest wykorzystywana do reakcji.

Komercyjne systemy testowe ATP wykorzystują reakcję lucyferyny/ lucyferazy, która jest bardzo powszechna w przyrodzie, do generowania światła widzialnego z energią dostarczaną przez ATP. Im więcej światła jest emitowane, tym więcej ATP jest obecne, co wskazuje na więcej pozostałości żywności lub więcej mikroorganizmów. Istnieje jednak jedno ważne zastrzeżenie: ponieważ systemy te są szeroko stosowane do walidacji skuteczności czyszczenia, środki dezynfekujące są również powszechnie zaangażowane w reakcję. Te środki dezynfekujące mogą zakłócać ściany komórkowe mikroorganizmów, ale zachowują ich ATP, co oznacza, że może nie być rzeczywistej korelacji między żywymi organizmami obecnymi na powierzchni a wynikami pomiaru ATP.

Metody ATP mają jeszcze jedną potencjalną wadę: ich zastosowanie różni się w zależności od wykrywanych pozostałości żywności. Na przykład, badanie ATP nie nadaje się do badania mąki pszennej, ponieważ jest to wysoce przetworzona matryca, która pozostawia niewiele ATP w swoich pozostałościach. Pozostałości produktów mięsnych zawierają jednak wysoki poziom ATP.

Metody wykrywania białka całkowitego

Jako kolejne podejście do badania pozostałości, metody wykrywania białka całkowitego nie badają samych mikroorganizmów, ale raczej aminokwasy, peptydy i białka. Testy te są bardzo szybkie i dostarczają wyniki w ciągu minuty. Wykrywanie nie jest wystarczająco czułe, aby wykryć białka z mikroorganizmów jednokomórkowych. Dlatego negatywny wynik tego typu testu nie oznacza braku mikroorganizmu. Ponadto nie ma sposobu na wykrycie określonych patogenów za pomocą tej metody. Jednak zestawy testowe do wykrywania białek mają swoje zastosowanie, ponieważ mogą dostarczyć wskazówek na temat skuteczności czyszczenia w szybki i niedrogi sposób.

Testowanie mikroorganizmów

Chromogeniczne metody hodowlane

Są to tradycyjne metody monitorowania higieny środowiska przetwarzania. Metody kulturowe zostały omówione w normie ISO 18593 "Mikrobiologia łańcucha żywnościowego - horyzontalne metody pobierania próbek powierzchni". Do wykrywania określonych organizmów można stosować podłoża nieselektywne i selektywne.

Metody oparte na agarze chromogennym

Ogólnie rzecz biorąc, istnieją dwa sposoby przeprowadzania metod opartych na agarze: bezpośrednio lub pośrednio poprzez etap rozcieńczania. Zaletą obu jest to, że zapewniają one wyniki ilościowe.

W metodach bezpośrednich agar na płytkach lub szkiełkach zanurzeniowych jest wyciskany bezpośrednio na badaną powierzchnię. Płytki kontaktowe mają kształt klasycznych szalek Petriego i zazwyczaj mają powierzchnię 25 cm². Szkiełka zanurzeniowe to dwustronne łopatki agarowe zabezpieczone plastikową rurką, o powierzchni agaru 7-10 cm² z każdej strony łopatki, co daje 14-20 cm². Systemy te nie wymagają dodatkowego sprzętu, a procedura pobierania próbek jest bardzo szybka. Jednak obszar pobierania próbek przy użyciu tej metody jest ograniczony.

Waciki, chusteczki i gąbki są narzędziami do pośredniego pobierania próbek. Po wymazaniu badanej powierzchni są one następnie rozcieńczane w roztworze buforowym, który jest następnie pipetowany do tradycyjnych płytek Petriego i rozprowadzany. Badana powierzchnia może być znacznie większa, a ciasne przestrzenie i szczeliny mogą być badane metodą pośrednią. Metody pośrednie mają jednak wadę: jest więcej etapów obsługi i potrzebne są dodatkowe materiały. Do wykrywania patogenów norma ISO zaleca powierzchnię od 1000 cm² do 3000 cm²; tak duży obszar może być obsługiwany tylko za pomocą gąbek lub wacików.

Metody wykrywania oparte na ciekłych pożywkach chromogennych

Ta metoda kulturowa jest używana tylko do wykrywania, ale nie do liczenia określonych organizmów lub grup organizmów, ponieważ nie zapewnia wyników ilościowych. W metodach opartych na pożywkach płynnych wymazy są używane do pobierania próbek, a następnie umieszczane w probówkach wypełnionych pożywką selektywną. Średnio inkubacja trwa co najmniej 48 godzin dla przypuszczalnie negatywnych wyników. Pozytywne próbki są identyfikowane na podstawie zmiany koloru lub florescencji przy określonej długości fali wzbogaconej próbki. Testy te są na ogół łatwe w użyciu i niedrogie.

Wadą systemów opartych na płynnych pożywkach jest ich niski stopień czułości, wynikający z zastosowania wysoce selektywnych pożywek, które celowo hamują wzrost innych bakterii. Istnieje tu pewne ryzyko: bakterie w środowisku przetwarzania są już zestresowane i mogą umrzeć, jeśli pożywki wzbogacające są zbyt selektywne. Z drugiej strony, jeśli selektywność jest zbyt niska, wykrycie określonych mikroorganizmów przy użyciu samych selektywnych pożywek płynnych może być trudne. Interpretacja wyników może stać się trudna i subiektywna, ponieważ zmiana koloru lub florescencja nie zawsze jest wystarczająco silna, aby wskazać ostateczny wynik. Główną zaletą metod opartych na pożywkach płynnych jest to, że są one łatwe w użyciu i niedrogie.

Metody oparte na DNA

Istnieją trzy różne metody oparte na DNA: izotermiczna amplifikacja DNA, PCR w czasie rzeczywistym i tradycyjna PCR. PCR w czasie rzeczywistym jest uznaną metodą wykrywania DNA lub RNA, podczas gdy izotermiczna amplifikacja jest bardziej nowatorską technologią. Istnieją wyraźne zalety stosowania amplifikacji izotermicznej w porównaniu z PCR w czasie rzeczywistym: na przykład amplifikacja izotermiczna nie wymaga termocyklera, ponieważ reakcja zachodzi w stałej temperaturze. Najbardziej opłacalną, ale także najbardziej pracochłonną metodą opartą na DNA jest tradycyjny PCR, ponieważ konieczne jest wykonanie etapu hybrydyzacji lub użycie raczej niespecyficznego barwnika po amplifikacji w celu wykrycia amplifikowanego DNA lub RNA. We wszystkich metodach określone części DNA lub RNA są rozpoznawane przez określone startery, a następnie namnażane przez enzym polimerazę. Czułość tych metod jest niezwykle wysoka, a regiony docelowe w DNA lub RNA są dobrze znane. Największym ograniczeniem tego systemu jest to, że jest to system oparty na enzymach. Enzymy potrzebują określonych roztworów buforowych do prawidłowego działania. Składniki środków dezynfekujących mogą wpływać na aktywność enzymów, co może prowadzić do wyników fałszywie ujemnych. Technologia ta wymaga również wielu etapów mikropipetowania, co może być poważnym źródłem błędów. Największą zaletą metod opartych na DNA jest to, że nieselektywne pożywki mogą być stosowane na etapie wzbogacania dzięki wysokiej czułości metody. Podłoża nieselektywne są przystępne cenowo, dostępne u różnych dostawców i wymagają najniższego poziomu bezpieczeństwa biologicznego (poziom 1). Możliwe jest również wykrycie niewielkich ilości patogenów na powierzchniach środowiskowych bez wzbogacania metodami opartymi na DNA, ale czułość jest niska w porównaniu z metodami opartymi na wzbogacaniu. Wreszcie, poważnym problemem mogą być fałszywie dodatnie wyniki fragmentów DNA patogenów, które zostały już zabite.

Metody immunologiczne

Testy immunologiczne to systemy wykorzystujące przeciwciała do wykrywania obecności mikroorganizmów w roztworach. Przeciwciała te mogą wiązać się z antygenami, takimi jak lipopolisacharydy na powierzchni komórek lub wici poszczególnych mikroorganizmów. Po pojedynczej lub wielokrotnej procedurze wzbogacania, która obejmuje pożywki selektywne, patogeny takie jak komórki Listeria są wykrywane za pomocą specyficznych systemów testowych opartych na przeciwciałach. Testy ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) były pierwszymi, które wykorzystywały technologię immunologiczną do wykrywania określonych mikroorganizmów. ELISA pozwala na ilościowe oznaczenie wykrytego analitu, ale konieczność uwzględnienia etapu wzbogacania wyklucza możliwość obliczenia stężenia początkowego. Tylko przeszkolony personel może wykonać wiele etapów transferu i płukania, których wymagają testy ELISA. Opracowanie urządzeń z przepływem bocznym, znanych również jako testy paskowe, rozwiązało ten problem, czyniąc procedurę wykrywania immunologicznego znacznie łatwiejszą i szybszą oraz eliminując obciążenie testami ELISA. Testy LFD z selektywnymi przeciwciałami stosowane w połączeniu z wysokowydajnymi pożywkami wzbogacającymi umożliwiają uzyskanie szybkich i dokładnych wyników bez konieczności stosowania drogiego sprzętu lub ponoszenia kosztów związanych ze szkoleniem.

Podsumowanie

Wybór odpowiedniej technologii testów higienicznych nie zawsze jest łatwym zadaniem. Istnieje kilka praktycznych kwestii, które będą miały wpływ na decyzję: ile miejsc pobierania próbek musi zostać przetestowanych i jak ważna jest przepustowość testów? W jaki sposób testerzy mogą zoptymalizować czas oczekiwania na wynik, biorąc pod uwagę, że testy na obecność niektórych bakterii chorobotwórczych nie są przeprowadzane codziennie i są bardziej zadaniem monitorującym niż procedurą kontroli jakości? Czy potrzebne są wyniki ilościowe, czy też wystarczające jest badanie obecności/braku? Ponieważ nadal nie jest możliwe uzyskanie liczby bakterii natychmiast po czyszczeniu, producenci mogą polegać na systemach testowania opartych na ATP lub białkach, które mogą służyć jako niejasny wskaźnik tego, czy można bezpiecznie rozpocząć produkcję, tj. czy ATP lub białko są obecne. Również przepisy krajowe mogą mieć wpływ na tę decyzję. Metody DNA lub immunologiczne oparte na wzbogacaniu są lepsze od innych metod pod względem czułości i selektywności i powinny być systemami z wyboru do wykrywania patogenów. Do wykrywania i liczenia organizmów wskaźnikowych lub monitorowania ogólnej higieny można stosować bardziej przystępne cenowo systemy, takie jak szkiełka zanurzeniowe lub systemy ATP.