Rewolucja czy zwykła ewolucja? Cytometria przepływowa i weryfikacja czyszczenia i dezynfekcji w zakładach produkcji żywności

Bezpieczeństwo żywności zależy w dużej mierze od warunków higienicznych panujących w zakładach produkujących żywność. Wysoki poziom bakterii powodujących psucie się żywności może wpływać na jej trwałość i jakość, a obecność patogenów (takich jak Salmonella i Listeria) może prowadzić do poważnych chorób. Producenci żywności muszą starannie utrzymywać swoje środowisko przetwarzania w czystości i wolne od patogennych mikroorganizmów, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu produktu końcowego. Ale jak to się obecnie robi?

Kontrola wzrokowa

Chociaż kontrola wizualna jest warunkiem wstępnym, sama w sobie nie jest wystarczająca. Jest to subiektywny i nieprecyzyjny sposób weryfikacji prawidłowego czyszczenia. Co ważniejsze, nawet jeśli na powierzchni nie ma widocznych pozostałości, nie oznacza to, że jest ona nieskazitelna. Kontrola wzrokowa nie może zapewnić, że wszystkie pozostałości żywności z poprzedniego cyklu zostały usunięte lub że środek odkażający skutecznie zmniejszył poziom drobnoustrojów na powierzchni.

Wyliczanie drobnoustrojów za pomocą metod opartych na kulturach

Są to tradycyjne metody monitorowania higieny środowiska przetwarzania. Ogólnie rzecz biorąc, istnieją dwa sposoby pobierania próbek: kontaktowe i wymazowe. W przypadku metod kontaktowych płytki lub szkiełka zanurzeniowe są umieszczane na powierzchni, z której pobierane są próbki, a następnie inkubowane. Pobieranie próbek metodą wymazową odbywa się za pomocą pałeczek lub gąbek, które są płukane w roztworze buforowym, a następnie zaszczepiane w sterylnym podłożu i inkubowane. Głównym ograniczeniem tych tradycyjnych metod oznaczania drobnoustrojów jest czas potrzebny do uzyskania wyników. Ponadto, większość gatunków bakterii nie może być hodowana na agarze, co jest zjawiskiem znanym jako anomalia wielkiej liczby płytek.

Wykrywanie ATP

Trójfosforan adenozyny (ATP) jest nukleotydem, którego komórki używają do dostarczania energii. Można go traktować jako molekularną "jednostkę waluty" dla energii we wszystkich żywych komórkach. Energia jest przekazywana, gdy ATP rozpada się na nukleozyd i wolny fosforan. Hydroliza kowalencyjnych połączeń fosforanów uwalnia energię, która jest wykorzystywana do reakcji. Komercyjne systemy testowe ATP wykorzystują reakcję lucyferyny/lucyferazy, która jest bardzo powszechna w przyrodzie, do generowania światła z energią dostarczaną przez ATP. Im więcej światła jest emitowane, tym więcej ATP jest obecne, co może pośrednio wskazywać na więcej pozostałości żywności lub (potencjalnie) więcej mikroorganizmów. Istnieje jednak jedno ważne zastrzeżenie: ponieważ systemy te opierają się na reakcji enzymatycznej, potencjalne inhibitory lub mniej niż optymalne warunki środowiskowe mogą powodować błędne wyniki. Temperatura otoczenia może wydłużyć czas reakcji, podczas gdy światło może utrudnić uzyskanie prawidłowych odczytów. Ponadto środki dezynfekujące mogą zakłócać reakcję, co oznacza, że może nie istnieć rzeczywista korelacja między żywymi bakteriami obecnymi na powierzchni a wynikami pomiaru ATP. Dlatego metody oparte na ATP są zwykle stosowane do testowania powierzchni przed zastosowaniem środka dezynfekującego. Metody ATP mają jeszcze jedną wadę: ich zastosowanie zależy od rodzaju przetwarzanej żywności. Większość żywności pozostawia pozostałości zawierające duże ilości ATP, które przewyższają o kilka rzędów wielkości ilości zawarte w komórkach bakteryjnych. W praktyce oznacza to, że systemy ATP nie mogą być wykorzystywane do oceny zanieczyszczenia mikrobiologicznego powierzchni w większości zakładów przetwórstwa spożywczego. Chociaż nie można bezpośrednio policzyć żadnych bakterii, systemy ATP są szeroko stosowane, ponieważ wyniki są generowane w ciągu kilku sekund, a czas uzyskania wyniku nie jest dostępny w żadnej innej powszechnie dostępnej technologii.

Wprowadzenie do cytometrii przepływowej

Cytometria przepływowa (FCM) odnosi się do grupy technik, które wykorzystują sygnały optyczne lub elektryczne do wykrywania i pomiaru określonych właściwości fizycznych lub chemicznych komórek i cząstek zawieszonych w płynie. Prawie 300 badań przeprowadzonych w latach 2000-2018 oceniło FCM jako narzędzie do charakteryzowania jakości wody pod względem mikrobiologicznym. Badania te były w stanie zilustrować wartość FCM w uzdatnianiu, dystrybucji i ponownym wykorzystaniu wody. Istnieją obecnie badania dokumentujące udane zastosowania FCM na tyle solidne, by sugerować, że mogą one zostać rozsądnie i realistycznie przyjęte jako rutynowa metoda oceny jakości wody. Co to wszystko ma wspólnego z oceną skuteczności czyszczenia i dezynfekcji w zakładach produkcji żywności? Metody wcześniej powszechne w określaniu jakości wody były często ograniczone przez niską czułość, wysokie wymagania dotyczące pracy i czasu, podatność na zakłócenia ze strony związków hamujących oraz trudności w rozróżnieniu między komórkami żywymi i nieżywotnymi. (To wszystko brzmi znajomo, prawda?) Ale proszę uważać: fluorescencyjne cytometry przepływowe są generalnie nieporęcznymi, drogimi urządzeniami, które wymagają wysoko wykwalifikowanego personelu do obsługi.

Przeniesienie możliwości cytometrii przepływowej do urządzenia przenośnego

Aby FCM stała się realnym rozwiązaniem do weryfikacji czyszczenia w zakładach przetwórstwa spożywczego, musi być dostępna w przenośnym formacie, który jest prosty i łatwy w użyciu, a jednocześnie wystarczająco dokładny, aby zapewnić wiarygodną liczbę bakterii i cząstek pozostałości w próbkach środowiskowych. Stało się to możliwe dzięki zastosowaniu impedancyjnej cytometrii przepływowej. Impedancyjna cytometria przepływowa jest specyficznym rodzajem cytometrii przepływowej: zamiast systemów optycznych, takich jak technologia laserowa, impedancyjne cytometry przepływowe wykorzystują prąd przemienny o różnych częstotliwościach, który umożliwia urządzeniu wykrywanie i zliczanie komórek i cząstek resztkowych oddzielnie. Podczas gdy optyczne cytometry przepływowe są w stanie zliczać tylko komórki znakowane barwnikami, impedancyjne cytometry przepływowe mogą wykonywać tę samą operację bez potrzeby znakowania. W porównaniu do innych urządzeń do cytometrii przepływowej, są one kompaktowe, przenośne i zasilane bateryjnie, dzięki czemu mogą być używane tam, gdzie pobierana jest próbka.

W jaki sposób impedancyjne cytometry przepływowe mogą rozróżniać komórki od cząstek resztkowych?

Elektromagnetyczne właściwości bakterii umożliwiają cytometrom przepływowym odróżnienie ich od innych cząstek. Cytoplazma i błona komórkowa bakterii zmieniają pole elektryczne w unikalny i możliwy do zidentyfikowania sposób. Podczas gdy prąd elektryczny przepływa przez cząsteczki metaliczne w większości bez przeszkód, cząsteczki nieprzewodzące stawiają opór polu. Nienaruszone bakterie przypominają jednak zarówno nieprzewodzące, jak i przewodzące cząsteczki: błona komórkowa zapobiega przenikaniu niskich częstotliwości, powodując, że przypominają one nieprzewodzące cząsteczki; przy wysokich częstotliwościach prąd elektryczny przenika jednak przez błonę. Mikroelektrody w impedancyjnym cytometrze przepływowym generują te pola elektryczne i umożliwiają urządzeniu ilościowe określenie zmian przewodności i oporności w kategoriach oddzielnych pomiarów nienaruszonych komórek i cząstek.

Zastosowanie impedancyjnej cytometrii przepływowej w bezpieczeństwie żywności: wprowadzenie CytoQuant®

Jak wspomniano powyżej, jedną z zalet impedancyjnych cytometrów przepływowych w porównaniu z innymi rodzajami urządzeń cytometrycznych jest ich przenośność. Lekkie, małe i zasilane bateryjnie, mogą pracować w terenie i w krytycznych punktach kontroli, gdzie higiena jest nadrzędną kwestią. Impedancyjny cytometr przepływowy CytoQuant® został zaprojektowany do użytku właśnie w takich obszarach, w tym w zakładach produkcji żywności i pomieszczeniach czystych. Impedancyjna cytometria przepływowa przynosi znaczne korzyści producentom żywności, którzy chcą zweryfikować swoje programy bezpieczeństwa żywności i czyszczenia: szybkie i oddzielne oznaczanie ilościowe bakterii i cząstek pozostałości (które mogą służyć jako wskaźnik skuteczności czyszczenia), czułość metody oraz solidność zestawu do wymazów i samego cytometru. System CytoQuant® jest łatwy w użyciu, ponieważ urządzenie wykonuje wszystkie czynności z wyjątkiem pobierania próbek. Test rozpoczyna się od pobrania wymazu ze zdefiniowanego obszaru (np. 20 x 20 cm lub 8 x 8 cali) badanej powierzchni. Następnie umieszcza się wacik w probówce zawierającej zastrzeżony, przewodzący roztwór, a następnie wstrząsa zestawem wacików, aby zawiesić bakterie. Podczas badania wody do płukania, próbka jest umieszczana bezpośrednio w pustej fiolce, a następnie dodaje się kilka kropli roztworu elektrolitu. Po wymieszaniu próbki, użytkownik wkłada fiolkę do CytoQuant®. Dwie igły penetrują dno rurki, łącząc ciecz z systemem przepływu w urządzeniu. Następnie, po wprowadzeniu roztworu do systemu przepływu, jest on przepuszczany przez elektrody w celi przepływowej. Po 30 sekundach urządzenie rejestruje oddzielne wyniki dla bakterii i cząstek i wyświetla je na ekranie.

Rewolucja czy ewolucja?

Mobilny cytometr przepływowy CytoQuant® umożliwia natychmiastową weryfikację na miejscu procedur czyszczenia i dezynfekcji w zakładach produkcji żywności lub innych obszarach, w których higiena ma kluczowe znaczenie. Dzięki bezpośredniemu oznaczaniu ilości bakterii i pozostałości cząstek na powierzchniach bez negatywnego wpływu środków dezynfekujących lub temperatury, zapewnia on znaczną przewagę nad urządzeniami ATP, a 30-sekundowy czas oczekiwania na wynik sprawia, że jest to doskonałe uzupełnienie programów higieny, które już wykorzystują metody kulturowe. Biorąc pod uwagę ogromny potencjał impedancyjnej cytometrii przepływowej, w pewnym momencie może ona zostać uznana za równą lub nawet zastępującą metody kulturowe jako standard w weryfikacji czystości. Byłaby to prawdziwa rewolucja w tej dziedzinie.