7 grzechów testowania GMO

Wykorzystanie genetycznie modyfikowanych (GM) upraw rośnie na całym świecie. Stwarza to wiele możliwości dla branży rolniczej, a jednocześnie stawia wiele wyzwań przed branżą analityczną. Jeden z ekspertów Romer Labs dzieli się swoją wiedzą na temat testowania upraw GM, aby mogli Państwo uniknąć popełniania typowych błędów w swoim laboratorium.

1. Identyfikacja niewłaściwego celu

Proszę odrobić pracę domową: jest to prawdopodobnie najbardziej podstawowy nawyk, jakiego może nauczyć się każdy naukowiec. Jest to szczególnie konieczne w przypadku testów organizmów zmodyfikowanych genetycznie (GMO), gdzie odrobienie pracy domowej oznacza wiedzę na temat tego, które zdarzenia składają się na cele, aby uniknąć fałszywie dodatnich i błędnych wyników. Problem dotyczy cech. Cecha to białko pochodzące z modyfikacji genetycznej, które nadaje roślinie specjalną cechę. Modyfikacje genetyczne mogą występować w różnych kombinacjach, które dają podobne lub zupełnie inne cechy. Do najpopularniejszych elementów modyfikacji genetycznych należą promotory (p35S, FMV), terminatory (NOSt), geny kodujące pewne użyteczne cechy (cp4 epsps, pat, bar, Cry1A i inne) oraz geny kodujące markery selektywne (NPTII, PMI). Państwa technicy muszą wziąć pod uwagę wiele różnych czynników przy definiowaniu celu dla każdej analizy GMO. Proszę upewnić się, że biorą Państwo pod uwagę terytorium, z którego pochodzi produkt, a także możliwe zdarzenia, czy zdarzenia te są dozwolone w danym regionie oraz czy interesująca roślina ma komercyjnie dostępne cechy biotechnologiczne. Może to być trudne: czasami modyfikacja istnieje, ale nie jest dozwolona lub nie jest sadzona w niektórych regionach. Może jednak być szeroko stosowana w innym regionie. Ponadto zdarzały się przypadki, że niezatwierdzone modyfikacje wymykały się spod kontroli i trafiały na pola uprawne.

2. Wybór wadliwej lub niewystarczającej metody

Może to być ryzykowna decyzja: jaki powinien być zakres badań przesiewowych GMO? Laboratoria mogą wąsko ukierunkować się na kilka elementów genetycznych lub białek, lub mogą rozszerzyć zakres na kilka zdarzeń lub białek, co może być kosztowne. Kluczowe znaczenie ma znalezienie metody, która odpowiada Państwa potrzebom i zapewnia dokładne wyniki. Metody oparte na DNA są czasochłonne i zależą od wysokiej jakości ekstrakcji DNA i odpowiednich kontroli. Zmienność liczby kopii i poliploidalność mogą również powodować problemy w próbkach i powinny być brane pod uwagę podczas przeprowadzania analizy DNA. Spojrzenie na niektóre popularne rośliny zilustruje ten punkt. W przypadku soi nie wystarczy testować tylko promotorów i terminatorów, ponieważ tylko kilka z 15 potencjalnych zdarzeń soi zawiera te wspólne elementy genetyczne. Kukurydza to zupełnie inna historia: szeroko zakrojone badania przesiewowe pod kątem tych elementów są prawie całkowicie wystarczające, ponieważ większość zdarzeń w kukurydzy zawiera te elementy. Podczas gdy metody oparte na DNA są drogie i stosowane tylko w laboratoriach analitycznych, identyfikacja białek jest stosunkowo tania i przydatna w badaniach przesiewowych pod kątem wspólnych cech na miejscu. Większość genetycznie zmodyfikowanych odmian ma swój własny poziom ekspresji zmodyfikowanych białek. Należy zachować ostrożność podczas przeprowadzania analizy białek soi i rzepaku za pomocą tych samych pasków urządzenia do przepływu bocznego (LFD). Tabela 1 podkreśla różne wskaźniki ekspresji CP4 EPSPS, co sprawia, że konieczne jest stosowanie różnych metod wykrywania LFD w soi i rzepaku. Właściwe podejście wykorzystuje różne testy i dostosowuje czułość dla różnych towarów, aby osiągnąć podobny poziom wykrywania.

3. Brak pełnego zrozumienia różnych stopni czułości testów

Metody oparte na DNA są bardzo czułe i są w stanie wykryć pojedynczą kopię genu docelowego. Czułość metod opartych na DNA jest ograniczona liczbą badanych nasion. Zwykle jest to 0,01% lub jedno genetycznie zmodyfikowane (GM) nasiono w zestawie 10 000 niezmodyfikowanych genetycznie nasion. Taka czułość jest więcej niż wystarczająca, aby mieć 99,9% pewności co do określonego poziomu wykrywalności do 0,1%. Z drugiej strony, metody oparte na białkach mają granicę wykrywalności (LOD) tak niską, jak 0,1% lub 1 genetycznie zmodyfikowane nasiono na 1000 nasion niezmodyfikowanych genetycznie. Jednak czułość ta nie jest wystarczająca, aby zagwarantować wynik z 99% pewnością. Najlepsze, co można uzyskać za pomocą testu pojedynczego białka o LOD 0,1%, to poziom 0,46% przy 99% poziomie ufności. Niejednolita dystrybucja nasion w rzeczywistych próbkach prowadzi do tej rozbieżności. Aby mieć 99% pewności, że poziom zanieczyszczenia GMO jest niższy niż 0,1%, zalecamy przeprowadzenie co najmniej czterech testów 1000 ziaren o czułości 0,1% każdy. Aby uzyskać 95% pewność na poziomie 0,1%, proszę przeprowadzić trzy testy po 1000 ziaren, wszystkie z wynikiem negatywnym.

4. Usuwanie zanieczyszczeń lub obróbka próbki

Laboratoria zbożowe często usuwają zanieczyszczenia z próbek przed przeprowadzeniem testu. Jednak oczyszczanie próbek GMO nie jest dozwolone. Jeśli w próbkach pozostaną jakieś pozostałości zawierające ślady roślin GMO, powinny one zostać wykryte. Na przykład, jeśli próbka kukurydzy zawiera pewne pozostałości soi GMO (ziarna, łupiny, pył), mycie i ręczne czyszczenie usunie te pozostałości i da nieprawidłowy wynik. Nie należy poddawać próbek jakiejkolwiek obróbce cieplnej, nawet w celu wysuszenia nadmiaru wilgoci. W szczególności w przypadku metod opartych na białkach mogłoby to spowodować denaturację białek cech i doprowadzić do całkowitej utraty czułości testu, ponieważ białko docelowe uległoby zmianie. Przeciwciała używane w tych zastosowaniach nie byłyby już w stanie rozpoznać swoich celów.

5. Użycie niewłaściwej procedury do przygotowania próbki

Państwa metoda izolacji DNA powinna być starannie zaprojektowana i przestrzegana, aby uniknąć degradacji DNA, która może wypaczyć wyniki. Dlatego ważne jest, aby zweryfikować jakość i ilość oczyszczonego DNA. Oprócz stosowanych odczynników do ekstrakcji DNA, bardzo ważna jest również metoda mielenia. Młynki ostrzowe dają najlepsze wyniki, ponieważ mielą wystarczająco drobno, aby umożliwić ekstrakcję DNA. Konieczne jest jednak dokładne wyczyszczenie każdego sprzętu do mielenia po użyciu, ponieważ zanieczyszczenie krzyżowe jest ogromnym problemem w testach GMO. Niewłaściwie wyczyszczony sprzęt może dawać fałszywie ujemne wyniki w kolejnych partiach. Ekstrakcja białek wymaga grubszego mielenia. Wystarczy po prostu zmiażdżyć wszystkie nasiona w próbce. Jeśli nasiona zostaną zmielone zbyt drobno, osadzenie się ekstraktu zajmie zbyt dużo czasu, a próbka będzie zawierać zbyt wiele cząstek stałych, które przykleją się do LFD i zahamują przepływ cieczy. Młyny używane do ekstrakcji przed analizą LFD powinny być ustawione tak, aby uniknąć powodowania zbyt drobnych frakcji. Należy również wziąć pod uwagę kształt naczynia ekstrakcyjnego: nie powinno być płaskie i lepiej jest używać naczyń jednorazowych, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Blendery są bardzo często używane do mielenia w celu badania białek, ponieważ są bardzo łatwe do czyszczenia, co pozwala uniknąć problemów z zanieczyszczeniem krzyżowym.

6. Dostosowywanie procedur testowych lub nieprzeczytanie ulotki dołączonej do opakowania

To może być najpoważniejszy grzech popełniany przez operatorów. Podczas gdy referencyjne laboratoria testowe zatrudniają przeszkolony personel przez cały rok, laboratoria zbożowe często mają sezonową politykę zatrudnienia, a zatem zatrudniają pracowników z mniejszą wiedzą specjalistyczną w zakresie testowania. Może to prowadzić do błędnego odczytania procedury testowej, nieprawidłowego jej przestrzegania lub zmiany w laboratorium. Może to mieć wpływ na wszystkie części procesu testowania, począwszy od ekstrakcji i wpływając na elementy testowania, takie jak objętości cieczy wymagane do testu, czasy rozwoju i procedury analizy. Proszę upewnić się, że dokładnie przeczytali Państwo wszystkie opakowania i dokumentację przed przeprowadzeniem jakiejkolwiek analizy, aby zapewnić wiarygodne wyniki.

7. Niewystarczające czyszczenie sprzętu (powodujące zanieczyszczenie krzyżowe)

Proszę upewnić się, że młynek używany do analizy GMO jest łatwy do czyszczenia. Najlepszym sposobem jest użycie wyjmowanych słoików i ostrzy, aby można je było czyścić oddzielnie od silnika młynka. Każdy element Państwa sprzętu powinien nadawać się do mycia. Blendery są powszechnie używane do mielenia próbek GMO, ponieważ są łatwe do czyszczenia. Młynki należy zdemontować i umyć wszystkie części osobno. Cały sprzęt należy umyć mydłem w płynie, a następnie spłukać wodą. Proszę nie używać etanolu jako środka czyszczącego; jego jedynym zastosowaniem jest przyspieszenie procesu suszenia. Każde laboratorium powinno zweryfikować swoją procedurę czyszczenia, aby zapewnić jej skuteczność. Zalecamy używanie rękawiczek podczas pracy ze wszystkimi próbkami. Zmiana rękawiczek i mycie rąk między próbkami również pomoże uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Proszę upewnić się, że wyczyścili Państwo wszelkie narzędzia, które mogły mieć kontakt z ekstraktem ze zmielonego materiału. Innym rozwiązaniem jest używanie w miarę możliwości sprzętu jednorazowego użytku.